作者：周丽 杨明武 李继东 刘霞
【摘要】 目的 探讨高频超声诊断兔模型动脉粥样硬化的价值。方法 将实验兔随机分为两组，每组10只，对照组喂以标准兔饲料，造模组喂以含1%蛋氨酸饲料，并于造模前及造模后8周测定血清中Hcy 和血脂，应用高频超声检测高同型半胱氨酸血症兔模型腹主动脉全程的内-中膜厚度(internal-media thickness， IMT)、斑块大小等，并与病理结果相对照。结果 造模组8周后血清中Hcy明显高于对照组，而血脂水平无明显差异，高频超声检测造模组血管内-中膜明显增厚，粗糙不光整，但未见明显粥样斑块形成。病理亦可见内-中膜增厚、粗糙，内膜中断，肌层平滑肌细胞空泡变性等早期动脉粥样硬化表现。结论 高频超声可以在粥样硬化斑块形成之前检测到血管内膜的改变，具有早期诊断动脉粥样硬化的价值。
【关键词】 高同型半胱氨酸血症;动脉粥样硬化;超声;病理
动脉粥样硬化(AS)一直以来都是医学领域研究的热点问题之一。同型半胱氨酸(Hcy)是体内的一种含巯基氨基酸，近年来的大量研究显示高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关[1-2]。本研究应用高频超声检测高同型半胱胺酸血症兔模型的血管内-中膜厚度等改变，并与相应主动脉病理诊断结果比对，以探讨高频超声诊断早期动脉粥样硬化的价值。
1 材料与方法
1.1 实验分组及动物模型的建立 雄性新西兰大白兔20只，购自四川省成都市医学动物中心，动物证号SCXK(川)2008-15， 雌雄兼有，3个月龄，体重 2.0～2.5 kg，均单笼单只饲养，自由饮水。适应性喂养15d后开始实验，将实验动物随机分为2组：正常对照组10只，喂以标准兔饲料;造模组10只，喂以含1%蛋氨酸饲料，饲养8周。
1.2 实验方法
1.2.1 血清总Hcy、TG、TC检测 分别于实验开始及8周空腹耳缘静脉采血5mL，离心 3000 转·分-1，10min， 及时分离血清并冷冻保存，成批测定血清中总Hcy、总胆固醇(TG)、甘油三酯(TC)。血清TG、TC的测定采用酶光度比色法，试剂盒为Olympus diaghostica GmbH Lismeehan，测定采用Au640奥林巴斯全自动生化仪。血清Hcy的测定采用循环酶法，试剂盒购自北京九强生物公司，测定采用Au640奥林巴斯全自动生化仪。
1.2.2 高频超声检测 采用GE Vivid7彩色多普勒超声仪，10MHz线阵探头。将兔仰卧位固定于兔台上，并将腹部备皮，为避免肠道内容物及气体干扰，于清晨空腹状态下由剑突下连续探测腹主动脉长轴及短轴切面至髂血管分支处。超声所定义的血管内-中膜的厚度为从内皮细胞的血管腔面至内弹力膜的最外层，即血管“双线征”之间低回声之间的距离。于检查所见血管内-中膜最厚处测量其厚度，如发现斑块则记录斑块大小及形成的部位，如未发现明显斑块则记录局部增厚处内-中膜测量值，未见明显局部增厚者则于三个不同部位测量血管内-中膜的厚度，记录其平均值。并将取样容积置于测量处血管中1/3，测量收缩期及舒张期峰值血流速度并计算阻力指数(RI)及S/D(收缩舒张比)值等参数。
1.2.3 组织病理学检测 于造模8周超声发现血管内-中膜有增厚、粗糙等阳性所见后用空气栓塞的方法处死家兔，沿腹正中线剪开腹部皮肤，分离主动脉，截取弓部至髂血管分叉处主动脉，纵行剖开动脉管壁，仔细检查管腔内壁有无粥样斑块形成，并记录斑块的大小及形成的部位并与超声所见做对照。然后以4%甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，HE染色，光镜观察。采用日本产bx50型奥林巴斯计算机图像分析系统测量血管内-中膜厚度。
1.3 统计学方法 所有数据均以(±s)表示，采用SPSS 11.5统计软件进行分析。同期两组之间的比较采用独立样本的t检验，同组不同期间两组的比较采用配对方差分析。P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 兔高同型半胱氨酸血症模型的判定
如表1所示，在实验开始时，正常对照组与造模组血清同型半胱氨酸、总甘油三脂、胆固醇等指标差异无统计学意义。造模前兔Hcy浓度符合正态分布，其95%可信区间为17.48～29.80μmol·L-1。造模8周后，造模组血清Hcy的水平明显高于造模前，其水平明显高于对照组亦显著超过此上限值，因此，可以认为高同型半胱氨酸血症兔模型造模成功。造模组8周后血清总甘油三脂、胆固醇等指标虽较造模前略升高，但差异无统计学意义(P&>0.05)。表1 高Hcy血症兔模型血清Hcy(μmol·L-1)和血脂(mmol·L-1)水平的变化
2.2 腹主动脉的超声表现及血流动力学参数
造模组与对照组间收缩期峰值血流速度(S)、舒张期峰值血流速度(D)、RI、S/D值等参数之间差异均无统计学意义(P&>0.05)，见表2所示。
2D超声示正常的兔主动脉内-中膜呈“双线征”，即两条平行的强回声之间为低回声所分隔，两条强回声之间的距离即为血管内-中膜的厚度。正常兔血管内-中膜纤细、光整，造模8周后造模组血管内中膜明显增厚、粗糙，血管内-中膜厚度(IMT)为(0.59±0.01)mm，和对照组之间差异有统计学意义，如表3所示。但造模组10只兔的主动脉均未探及明显斑块，管腔亦未见狭窄。表2 造模组与对照组血流动力学参数的比较(造模8周后)
2.3 高Hcy血症兔超声检测及病理诊断结果的对比 病理取材时先观察标本的大体组织形态，仔细查找未见肉眼可见的斑块后，于感官认为内膜最厚处取材、包埋、切片，并与超声结果做比较。对照组在8周后血管内膜仍纤细、完整，造模组在特殊饲料造模8周后主动脉肉眼未见明显变化，超声及病理切片亦均未见明显的粥样斑块形成，但超声可见造模组血管内膜增厚、粗糙、连续性中断等早期动脉粥样硬化的表现，病理结果也显示血管内-中膜增厚、粗糙，部分血管内膜中断等表现，肌层平滑肌细胞可见空泡变性，与超声所见相一致，见表3所示。表3 造模组与对照组超声和病理IMT值
3 讨论
Hcy是体内蛋氨酸经脱甲基等一系列反应生成，它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要的中间产物。当在遗传及环境作用下，血液中Hcy浓度超过正常范围称为高Hcy血症。高Hcy血症致动脉粥样硬化的病生理机制复杂，目前认为可能有[3-4]①Hcy对血管内皮细胞具有毒性作用。Hcy巯基内脂可与低密度脂蛋白结合形成集合体，经内皮吞噬形成泡沫细胞后，构成新的动脉粥样硬化斑块。②NO介导的内皮依赖性舒张功能明显受损。Hcy可诱导平滑肌内某些基因的表达，使平滑肌细胞中mRNA合成增加，促使平滑肌细胞增殖。③破坏机体凝血与纤溶之间的平衡，通过形成同型半胱氨酸巯基内酯后与反式视黄醇引起血小板凝集。
国外多选用小型猪、狒狒和猴等大型哺乳动物来复制高同型半胱氨酸血症和动脉粥样硬化模型，效果好，但经费昂贵[5-6]。国内目前多选用新西兰大白兔来制作模型，但在给药方法、药物浓度、造模时间等方面文献报道的结论不一。李丽帆等[7]研究采用15mg·kg-1·d-1Hcy皮下注射的方法，认为4周可形成高同型半胱氨酸血症，且可造成髂总动脉狭窄，11周时可在主动脉形成粥样硬化。徐叔云等[8]采用皮下注射同型半胱氨酸硫代内脂15mg·kg-1·d-1)的方法，认为3周左右可形成动脉粥样硬化。王兴华等[9]采用饲喂1%蛋氨酸饲料的方法。本研究采用喂以含1%蛋氨酸饲料的方法来复制高Hcy血症模型，方法简便易操作，其间无1例实验动物死亡。参考上述作者置备动物模型的时间，我们于试验开始后5周每周随机抽取造模组实验兔1只，在超声下检测腹主动脉IMT，8周后观察到较明显的内中膜改变后开始检测。8周后血浆Hcy浓度为(56.91±18.26)μmol·L-1，明显高于对照组，达到了兔高Hcy血症的诊断标准，造模效果满意，为本研究提供了可靠的动物模型。
多数学者认为IMT 增厚是AS的早期表现。高频超声的出现大大提高了组织的显现力和分辨力，10MHz线阵探头的分辨力可以达到0.1mm ，因此可以清晰显示血管壁的三层结构，测量血管内-中膜的微细变化。本研究采用高频超声来观察高Hcy血症兔模型主动脉血管内膜的改变。国内有研究采用观察髂血管及颈部血管的方法来观察兔高Hcy血症形成粥样硬化病变的情况，且证实了粥样病变首先在中小动脉形成的理论。但我们在研究中体会到兔与小型猪、狒狒和猴等大型哺乳动物相比本身形体较小，其血管内径相应亦较小，呼吸频率较快且对腹主动脉声像图影响较大，即使高频超声也难以探查到兔髂血管及颈部血管并清晰显示内-中膜。因此我们选择采用观察主动脉的方法来评价高Hcy血症的血管改变。造模8周后，造模组未见明显的粥样斑块形成，是否在髂血管、颈动脉等中小血管形成粥样斑块还有待于后续的病理检查来证实。但我们观察到造模组8周后血管内-中膜较对照组明显增厚，且呈粗糙、不完整等AS形成的早期改变。病理结果也显示血管内-中膜增厚、粗糙，部分血管内膜中断，肌层平滑肌细胞可见空泡变性等，病理IMT测值较超声偏小，与文献报道的结论一致，考虑与以下因素有关[10]：① 病理通过细胞对IMT的界定与超声通过组织界面回声反射的不同对IMT的界定不完全相同;②病理在组织固定后轻度缩水;③ 病理为高倍镜下测量，对组织结构的分辨力更高、测量误差较超声更小等因素有关，但超声可以良好的反应IMT增厚、粗糙等改变，与病理结论相一致。8周后造模组TG和TC虽较对照组略有升高，但差异无统计学意义，因此可以认为高Hcy血症是致兔动脉粥样硬化的一个相对独立的危险因素。
综上所述，高频超声可以在粥样硬化斑块形成之前检测到早期动脉粥样硬化出现的血管内膜改变，有助于动脉粥样硬化的早期诊断。我们在超声检测时还体会到兔为哺乳动物，清晨空腹检查可以避免肠道内容物及气体的干扰，提高图像的质量，同时主动脉后壁双线征较前壁更清楚，内-中膜厚度的测量在后壁更容易。
参考文献
[1] 鲁洋，李淑梅，张小昊，等. 同型半胱氨酸水平对冠心病的影响[J]. 中国老年学杂志， 2010， 30(1):101-102.
[2] 汤勇，杜安全，沈英，等. 同型半胱氨酸与血脂水平及在冠心病中的相关性研究[J]. 实验与检验医学， 2009，27(4):413-435.
[3] 左慧敏， 刘贵京， 魏红， 等. 高同型半胱胺酸与心血管疾病的相关研究述要[J]. 中医药学刊， 2003，21(4): 600-602.
[4] 黄荣宁，周祖文.同型半胱胺酸与心脑血管疾病关系的研究进展[J]. 右江医学，2005，33(5):527-528.
[5] Lentz SR， Malinow MR， Piegors DJ， et al. Consequences of hyperhomocysteinemia in vascular function in atherosclerotic monkeys[J]. Arterioscler Thromb Vac Biol，1997，17(2):930-934.
[6] Young PB， Kennedy S ， Molloy AM， et al. Lipid peroxidation induced in vivo by hyperhomocysteinaemin in pigs[J]. Atherosclerosis， 1997，129:67-71.
[7] 李丽帆， 顾国龙， 吴芳， 等. 同型半胱胺酸致兔动脉粥样硬化的实验研究[J].广西医学， 2007，29(5):625-626.
[8] 徐叔云， 卞如濂， 陈修. 药理学实验方法[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社:202.
[9] 王兴华， 高奋， 李杰，等. 高同型半胱氨酸兔模型腹主动脉超声表现的实验研究[J]. 中华超声影像学杂志， 2003， 12(7): 435-437.
[10] 王家祥， 方平， 肖湘生， 等. 超声评价兔动脉粥样硬化的实验研究[J]. 中国医学影像技术，2006，22(2): 212-215.