作者：王洁 王淑静 张炎 朱佳佳 王强
【摘要】 目的 探讨茜草醇提浸膏对刀豆蛋白A (ConA)致小鼠急性肝损伤的保护作用。方法 采用昆明种小鼠，灌胃给予6、10、16g·kg-1·d-1的茜草醇提浸膏和联苯双酯滴丸溶液(0.2g·kg-1·d-1)灌胃。14d后尾静脉注射ConA 20mg·kg-1制备小鼠急性肝损伤模型，8h后取血用化学比色法检测血清ALT、AST活性;同时用酶联免疫法测定肝组织匀浆中IL-1β、TNF-α、IL-4 、IL-10含量的变化及观察肝脏病理学变化。结果 与模型对照组相比，茜草醇提浸膏16g·kg-1·d-1组小鼠ALT、AST活性明显降低(P&<0.01)，肝组织匀浆中IL-1β、TNF-α的含量明显下降(P&<0.01)，IL-4、IL-10含量升高(P&<0.01)，能明显改善肝组织的病理学损伤。结论 茜草醇提浸膏对ConA所致小鼠急性肝损伤具有保护作用。
【关键词】 茜草;急性肝损伤;细胞因子;刀豆蛋白A
茜草(Radix Rubiae Cordifoliae)属植物所含的化学成分主要有醌类、环己肽类、三萜类和多糖等，其药理作用主要有解热镇痛、抗炎、抗氧化、抗癌、促凝和抗凝、抑制病毒复制、稳定肥大细胞等作用[1]。本研究主要通过对茜草(地上部分)醇提浸膏能否调节刀豆蛋白(ConcanavalinA，ConA)引起的免疫性肝损伤血清中Th1/Th3细胞因子网络，观察其是否有保护肝脏的作用。
1 材料与方法
1.1 药品 茜草，茜草醇提取浸膏由本室提取(用75%的乙醇提取3次，回收乙醇，得到浸膏)。
1.2 实验动物 雄性昆明种小鼠60只，体重(20±2)g，8周龄，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物合格证号: SCXK(宁)2005-0001。
1.3 主要试剂 ConA Ⅳ型(美国Sigma公司);联苯双酯滴丸(Bifendate pills，浙江万邦药业有限公司，批号 0701003)，多聚甲醛(天津市福晨化学试剂厂，批号 20080112)，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20090815)。IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号 2009.8.20)。
1.4 主要仪器 721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);高速低温离心机(日立公司 CF16RX);DK-S14型电热恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)，550酶标仪(Bio-RAD公司)。
1.5 方法[2] 将小鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组，模型对照组，联苯双酯组(0.2g·kg-1·d-1)，茜草醇提浸膏高(16g·kg-1·d-1)、中(10g·kg-1·d-1)、低剂量组(6g·kg-1·d-1)。各组均灌胃给药，容量为0.2mL·10g-1·d-1，空白对照组和模型对照组给予等容量生理盐水，每天1次，共14d。末次给药4h后，除正常对照组尾静脉注射生理盐水外，其余各组动物均一次性尾静脉注射ConA 20mg·kg-1。禁食，不禁水，8h后摘小鼠眼球取血，3000r·min-1，离心10min，收集血清待测。取左叶相同部位肝脏，4%多聚甲醛固定作病理切片。取肝左叶组织0.5g，用冷生理盐水洗去浮血，拭干，加冷生理盐水制成10%肝匀浆，3000r·min-1，离心10min，取上清液待测。
1.6 测定指标 血清ALT、AST活性均按试剂盒要求测定;肝组织匀浆IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 采用ELISIA检测试剂盒按说明测定。
1.7 统计学方法 用SPSS统计软件计算结果以均数±标准差(±s)表示，两组样本均数间比较采用t检验，多组样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，P&<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 肝脏组织病理学观察 正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色，质地软而富有弹性;肝小叶结构完整，细胞排列整齐，无炎细胞浸润。模型对照组小鼠肝脏体积增大;肝细胞变性明显，可见细胞气球样变，胞浆疏松化及灶状坏死，严重的呈片状坏死，汇管区可见大量炎症细胞浸润，呈片状坏死。联苯双酯组和茜草醇提浸膏高剂量组肝脏略有水肿，质地柔软;肝小叶结构基本完整，细胞排列较整齐，只有少量的炎细胞浸润，较模型组有明显改善。茜草醇提浸膏中、低剂量组小鼠肝脏体积也有所增大，肝细胞亦有变性，细胞气球样变，局部有灶状坏死，炎细胞浸润较多，较模型组有所改善(图1，见封4)。
2.2 茜草醇提浸膏对血清ALT和AST的影响 与模型对照组相比，茜草醇提浸膏各剂量组可使ConA所致肝损伤小鼠血清ALT、AST活性显著降低(P&<0.05)，结果见表1。
2.3 茜草醇提浸膏对肝脏匀浆中细胞因子的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝组织中IL-1β、TNF-α含量明显升高(P&<0.01)，IL-4与IL-10含量显著下降(P&<0.01)。与模型对照组相比，茜草醇提浸膏高、中剂量组可显著降低肝组织中IL-1、TNF-α(P&<0.01，P&<0.05)，并使IL-4、IL-10含量明显升高(P&<0.01，P&<0.05)，结果见表2。表1 茜草醇提浸膏对ConA致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响
3 讨论
有关肝病的动物模型种类较多，包括化学性、药物性、酒精性、免疫性肝损伤等，其中ConA诱导的免疫性肝损伤模型与人类肝脏自身免疫性疾病和病毒性肝炎免疫性肝损害的发病机制很相似。ConA是一种对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素，可发挥丝裂原作用激活T细胞。辅助性T淋巴细胞(Th)主要分为两类：Thl和Th3。Thl主要产生细胞因子IL-1β、TNF-α，起到介导细胞免疫和细胞毒作用，促进炎症的发生;Th3主要产生细胞因子IL-4、IL-10，抑制炎症的发生。因此Thl/Th3细胞因子有相互抑制和调节的作用，机体正常状态时Thl/Th3处于相对平衡状态，这种平衡状态被打破就会引起疾病的产生。
ConA诱导肝损伤后，Th1细胞因子大量分泌，导致了Th1/Th3细胞因子的失衡[3-4]，细胞因子失衡，导致并促进了炎症的发生、发展，促进肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。在致炎因子的作用下，巨噬细胞在肝内大量聚集是肝损伤的病理基础。辅助性T细胞和巨噬细胞是ConA诱导肝损伤模型的主要效应细胞。一方面肝窦内被激活的巨噬细胞产生细胞因子直接损伤肝细胞;另一方面在脾脏中活化的大量T淋巴细胞及其细胞因子，使细胞因子网络失衡，这些炎症细胞因子随血流到达肝脏，直接与肝细胞接触或进一步激活巨噬细胞，破坏血管内皮导致肝损伤，并能通过多种途径诱导肝细胞凋亡[5]。促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α)通过活化细胞、体液免疫，促进趋化因子、细胞因子、黏附分子表达，从而放大炎症反应;细胞因子IL-4作为抗炎细胞因子，能抑制促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α的作用。不仅如此，IL-4还能激发多种细胞因子抑制剂的合成，如IL-1受体拮抗剂[6]。IL-10是细胞因子合成的抑制因子，IL-10能抑制人单核细胞、中性粒细胞等产生促炎细胞因子[7]。
结果显示茜草醇提浸膏的16、10g·kg-1·d-1组均能降低血清ALT、AST，减轻肝脏病理改变，其机制与其调节Th1/Th3细胞免疫功能，降低肝组织内Th1细胞因子(TNF-α、IL-1β)含量，并升高Th3细胞因子(IL-4、IL-10)含量，抑制ConA所致肝损伤局部的炎症反应有关。有关茜草对抗肝损伤的其它机制还有待进一步研究。
参考文献
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