【摘要】 目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)在膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中的表达及意义。方法：采用免疫组化法，对BTCC组织中VEGF蛋白的表达及生物学意义进行了研究。结果：63例BTCC患者中VEGF蛋白阳性表达率为47.6 %(30/63)，10例正常膀胱黏膜组织VEGF蛋白的表达为阴性。结论：VEGF蛋白的阳性表达率随肿瘤分级、分期的升高而明显增高，用免疫组化法检测VEGF对评估膀胱癌预后有一定价值，可作为膀胱癌的生物学肿瘤标志物。
【关键词】 血管内皮生长因子;膀胱移行细胞癌;免疫组织化学
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，复发率很高，生物学行为复杂，在泌尿系统肿瘤中，其发病率和死亡率都是第一位的。所以，深入研究其生物学行为，对治疗和预防复发都有深远的意义。血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是一种有高度特异性的促进血管内皮细胞分裂、诱导血管形成的因子，是肿瘤的生长、浸润和转移过程中不可缺少的物质。我们利用免疫组化技术检测膀胱移行细胞癌(BTCC)中VEGF蛋白的表达，以探讨它在BTCC发生发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 选包头市中心医院泌尿外科2004-2006年间手术切除的原发性BTCC存档蜡块标本63例，其中男性56例、女性7例，年龄29～81岁，平均60.5岁。病理分级按WHO标准分为:G1级12例，G2级35例，G3级16例。临床分期按国际抗癌联盟UICC-TNM标准分为:浅表型(Tis-T1期)34例，浸润型(T2-T4期)29例。膀胱肿瘤直径大于3 cm的27例，小于3 cm的36例。肿瘤数目：单发34例、多发29例，其中随访2年中复发26例。10例正常膀胱黏膜取自经膀胱前列腺切除手术的标本做对照。每个蜡块做4 μm连续切片2张，一张行HE染色复查诊断，另一张行免疫组化研究。
1.2 免疫组化染色 采用S-P法，VEGF单克隆抗体和SP试剂盒购自福州迈新公司。实验步骤按试剂盒说明书进行，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，用3，3-二氨基联苯胺(DAB)显色。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，以已知VEGF蛋白阳性的BTCC组织切片作阳性对照。
1.3 免疫组化染色阳性细胞定位 VEGF蛋白阳性定位于细胞胞浆和细胞膜，呈棕黄色颗粒。
1.4 结果判定 每例组织切片在免疫反应最强的区域选择5～10个视野(400倍)，使用目镜网格测微尺计数1 000个细胞，计算阳性细胞比例平均值，其中阳性细胞数&<10 %为阴性表达，阳性细胞数≥10 %且&<25 %为弱阳性，阳性细胞数在≥25 %且&<50 %之间为阳性，阳性细胞数在≥50 %为强阳性。
1.5 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，采用χ2检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF蛋白表达与BTCC生物学行为的关系 10例正常膀胱黏膜组织中VEGF蛋白表达阴性。在63例BTCC中，VEGF蛋白阳性表达阳性30例(47.6 %)，其中弱阳性15例，阳性8例，强阳性7例。肿瘤复发26例中，阳性25例。
2.2 BTCC临床参数间的相互关系 随着肿瘤分级、分期的增高，各组间复发率比较差异均有统计学意义(P&<0.01)，见表1。表1 肿瘤复发与BTCC分级、分期的关系
2.3 VEGF蛋白表达与BTCC临床参数间的相互关系 VEGF蛋白的阳性表达率随病理分级、临床分期递增(P&<0.01)，在复发肿瘤中表达更高(96.1 %)，说明VEGF蛋白的阳性表达与BTCC的生物学行为密切相关，并提示VEGF基因高表达是BTCC的晚期表现更明显。见表2。表2 VEGF蛋白在BTCC中的表达
3 讨论
BTCC是最常见的膀胱癌组织类型，其在泌尿生殖系统中的高发病率和高复发率是临床泌尿科医生所面临的重要问题，亦是膀胱癌手术后由于复发、转移而导致患者死亡的主要原因。目前尽管有手术、化疗、免疫治疗等多种方法，但还没有一种方法能从根本上治疗BTCC。究其原因是由于迄今仍不能对BTCC做出早期诊断和对其发病机制的认识不甚清楚。传统的TNM分期和细胞分级标准不能充分反映BTCC的生物学特征，需要进一步寻找新的肿瘤分子标记物来早期诊断并预测肿瘤复发或转移的风险。
膀胱癌发展过程是多因素多阶段的演变过程，除与致癌基因活性和抑癌基因数量有关外，还与多种生物学因素有关，血管形成在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视。1983年Senger等在豚鼠肿瘤腹腔渗液及多种肿瘤细胞培养液中发现了一种可使豚鼠皮肤血管通透性增高的因子，命名为血管通透性因子(Vascular permeability factor，VPF)。至1989年，Ferrara等在牛垂体滤泡细胞体外培养液中首先将其纯化，因其为特异性促血管内皮细胞有丝分裂的因子，故命名为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。目前发现，VEGF是高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂素和提高血管通透性最强的因子[1]。它能特异地作用于血管内皮细胞，刺激其增生及移行，诱导新生血管的生成。研究还认为，VEGF的高表达与肿瘤患者的生存时间、早期复发、浸润及转移等有关[2]。
VEGF的表达也受到原癌基因及抑癌基因的表达产物的调控[3]。研究显示膀胱癌等许多肿瘤细胞均有VEGF高表达，而正常膀胱移行上皮中VEGF表达极弱或不表达。膀胱癌是一种血管丰富的实体肿瘤，其生物学行为复杂多变，突出表现为易复发、多发、浸润和转移等，在膀胱癌的整个发生、发展过程中血管生成几乎贯穿始终。研究结果表明，由肿瘤细胞分泌或细胞外基质启动的血管生成活性因子VEGF、TGF-β、FGF等在肿瘤血管新生中起重要的作用。其中VEGF最为重要，且特异性高，与肿瘤的浸润转移有关。王蒿等[4]发现VEGF表达与膀胱癌微血管密度密切相关性，说明VEGF在膀胱癌的微血管生成过程中发挥正性调节作用，是主要的血管生成因子。都书琪等[5]亦发现VEGF的表达随膀胱癌的分级和分期增加而升高，且表达高者术后复发率高，提示VEGF的表达与膀胱肿瘤的恶性程度和复发密切相关，其阳性表达可作为膀胱癌早期复发及预后的指标，是膀胱癌生物学行为的一个较为理想的标志物。
本组研究结果发现，在10例正常膀胱黏膜中VEGF均无阳性表达，63例BTCC，有30例VEGF蛋白阳性表达，阳性率为47.6 %。VEGF阳性表达率与膀胱肿瘤的数目、大小及患者的性别、年龄无关，与膀胱肿瘤复发有关。VEGF表达率随BTCC的组织学分级、临床分期增高而增加;在复发或浸润性膀胱癌组织中VEGF的表达明显高于浅表性或无复发的膀胱癌组织;提示VEGF的表达与BTCC的组织学分级、临床分期、肿瘤复发密切相关，即VEGF表达越强，膀胱癌分化越差，肿瘤浸润越深，恶性度越高，复发更迅速，预后越差。
临床及实验研究表明血管新生是实体肿瘤转移的先决条件，一旦肿瘤生长超过简单扩散的点，肿瘤细胞进一步扩散就需要新的毛细血管。VEGF在膀胱癌的诊断和预后有重要作用。目前针对VEGF的靶点治疗已经取得了令人兴奋的成就[6]，但是肿瘤的发生发展是多因素的，对于膀胱癌的抗血管治疗还需要进一步研究。我们相信，随着VEGF单抗的完善及其他药物的联合运用，在膀胱癌的治疗方面会有新的突破。
参考文献
[1] 范海涛，刘禄成，李志，等.抗人膀胱癌/抗VEGF双功能基因抗体对膀胱癌生物学行为的影响[J].临床泌尿外科杂志，2005，20(7):428-429.
[2] 叶雄俊，张志文，郭应禄.血管内皮生长因子在膀胱癌预后判断和监测复中的意义[J].中华泌尿外科杂志，2002，23:443.
[3] 高渝.VEGF在膀胱肿瘤中的作用与研究进展[J].重庆医学，2007，63(4):355-357.
[4] 王蒿，夏同礼.膀胱癌组织中血管内皮生长因子的表达及与血管生成的关系[J].中华泌尿外科杂志，2000，38(1):34.
[5] 都书琪，杨春明，孔垂泽，等.VEGF及PD-ECGF在膀胱癌的表达及与肿瘤血管生成的关系[J].中国医科大学学报，2002，31(2):108.
[6] 刘禄成，范海涛.以VEGF/VEGFR为靶点的膀胱癌治疗[J].国际肿瘤学杂志，2006，33(5):380.