医学技术论文参考资料：双酚A对孕妇绒毛组织的影响探索

前言

BPA是一种环境内分泌干扰物,具有类雌激素样作用。BPA进入机体后与细胞内雌激素受体结合,通过多种机制产生类雌激素或抗激素作用,从而干扰内分泌系统的正常功能,对机体产生多方面的影响。国内、外研究发现,在胚胎发育早期,低剂量BPA可影响人类的生长发育、性成熟、血液的激素水平、生殖器官的功能、免疫功能、脑细胞某些酶的活性和信号转导等。动物实验结果发现,BPA可以引起小鼠绒毛间质水肿、纤维素样坏死、胎盘功能障碍及胚胎的发育异常等。本中心就BPA对人早孕绒毛组织结构的影响的研究发现,BPA可导致绒毛发生病理学改变,同时发现BPA可刺激早期绒毛细胞分泌毬灢HCG。BPA是否对妊娠带来高风险值得深入的研究。因此,本实验拟通过分析BPA对人早孕绒毛的毒性作用及对胚胎发育的影响,探索BPA对人类妊娠可能存在的危害。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂
二氧化碳培养箱,超净工作台,倒置显微镜,MK3酶标仪(美国Thermo公司)。BPA(天津市大茂化学试剂厂产品),1640培养基 (sigma公司生产),人绒毛膜促性腺激素βHCG(丽珠医药),酶联免疫吸附测定试剂盒(上海武昊生物公司生产)。

1.2 实验分组及孕妇基本情况
取孕6~8周人工流产新鲜绒毛组织40份,分为4组,使BPA的终浓度分别为1000×10-6g/L(A组),500×10-6g/L(B组),1×10-6g/L(C组),D组为培养液对照组,每组10例。孕妇年龄为22~35岁,无心、肝、肾等严重疾病和生殖道感染性疾病。孕妇各组年龄、妊娠天数比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。新鲜绒毛组织经洗涤剪去蜕膜后,每份取绒毛0.5g用于实验。BPA溶于无水乙醇中稀释成不同浓度,随培养液加入各培养瓶。

1.3 体外培养
将新鲜绒毛0.5g置于5mL的1640培养液中,于370C、5%二氧化碳、95%湿度的培养箱中培养。培养液中加入不同浓度溶于乙醇的BPA,收集第1天、第3天的培养液,-200c冷冻保存,待ELISA检测TGFβ1、ADAM12、IGF1的浓度。

1.4暋ELISA检测培养上清TGF毬1、ADAM12及IGF1浓度
采用双抗体夹心ELISA法定量检测培养上清中TGFβ1、ADAM12及IGF1的浓度,按照人TGFβ1、ADAM12、IGF1的ELISA试剂盒的操作步骤检测上清液TGFβ1、ADAM12、IGF1的OD值。人TGFβ1检测敏感度为15.8pg/mL,板内、板间变异系数<7.2%;人ADAM12检测敏感度为24pg/mL,板内、板间系数<6.5%;人IGF1检测敏感度为0.182pg/mL,板内、板间变异系数<6.4%。实验重复2次,每次设2复孔。

1.5 统计学处理
SPSS for windows 12.0建立数据库,用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BPA对TGFβ1分泌的影响
含BPA的A、B、C组TGFβ1浓度递减,而对照组(D组)呈递增变化;各组第3天与第1天TGFβ1浓度的比较有统计学差异(P<0.05)结果。对各组第3天与第1天TGFβ1浓度之间进行协方差分析,结果显示组间差异有统计学意义(P<0.05),提示培养液中TGFβ1的浓度与BPA呈负相关,BPA对培养液TGFβ1的浓度呈量效关系。......

2.2 BPA对ADAM12分泌的影响
含BPA的A、B、C组ADAM12浓度降低,对照组D组的浓度降低;各组第3天与第1天AD-AM12浓度的比较有统计学差异(P<0.05)结果。对各组第3天与第1天ADAM12浓度之间进行协方差分析,结果显示组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 BPA对IGF1分泌的影响
含BPA的A组IGF1浓度升高,B组,C组的浓度降低,对照组D组的浓度升高;各组第3天与第1天IGF1浓度的比较无统计学差异(P>0.05)结果。对各组第3天与第1天IGF1浓度之间进行协方差分析,结果显示A组与D组间差异无统计学意义(P>0.05),B组,C组与D组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

TGFβ1具有调节细胞增生与分化,调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质的粘连,促进细胞外基质的合成及调节免疫耐受等多项生理功能。研究发现在小鼠及猪胚胎着床窗期,子宫内膜细胞外基质、官腔液及早期发育胚胎中TGFβI均呈高表达,使胚胎着床部位内膜结构重塑而利于滋养细胞的植入,促进胚胎种植。本实验发现,加入不同浓度的BPA的绒毛培养中TGFβ1的浓度有降低,而且BPA浓度与TGFβ1的浓度呈负相关,可证明BPA对胚胎发育的毒性作用。动物实验结果发现,在1pmol/L~1nmol/L的双酚A下对体外培养的小鼠胚胎具有一定的毒性作用,其中对卵黄囊胎盘的结构和功能的影响可能是其发育毒作用的重要基础之一。
ADAM12是蛋白水解酶,可以水解类胰岛素样生长因子结合蛋白,通过类胰岛素样生长因子结合蛋白释放胰岛素样生长因子来促进胎儿的生长和发育。本实验测定ADAM12浓度值,发现不同浓度的BPA对绒毛组织中ADAM12的表达均有抑制作用。龙鼎新等发现,BPA干扰胚胎发育过程中脏层卵黄囊(VYS)的结构和功能。60mg/L以上的BPA在影响培养大鼠胚胎生长发育的同时,对VYS血管分化不良,提示其造血功能降低,使得胚胎生长发育所需的氧和营养物质得不到供应,造成胚胎缺氧和新陈代谢紊乱,从而导致胚胎发育异常。
BPA可通过模拟雌二醇(E2)以竞争性方式与雌激素受体(ER)结合,ER活化后进入细胞核,与DNA上雌激素反应元相结合,调节靶基因的转录,使许多蛋白表达,如生长因子相结合,调节靶基因的转录,使许多蛋白表达,如生长因子。Klotz等发现,BPA处理后小鼠子宫胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA水平增高,IGFβ1受体磷酸化,认为外源性雌激素通过激活子宫IGF-1信号通路发挥拟雌激素样效应。本实验不同浓度的BPA组,IGF-1浓度变化不明显,BPA浓度为1000×10-6g/L时对IGFβ1表达有刺激作用,提示双酚A具有微弱的类雌激素作用。
当前双酚A对人类生殖毒性影响的研究较少,而且低剂量的双酚A对慢性生殖毒性研究更有意义。此外单纯的某一机制并不能解释双酚A的毒性,更加全面深入地研究对进一步揭示双酚A的致毒机制更有意义。