关于原发性肝癌中抑癌基因TSLC1蛋白的表达及其临床意义

【摘要】 目的: 通过检测肺癌肿瘤抑制物1(TSLC1)蛋白在原发性肝癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系，探讨其在肝细胞肝癌发生、发展过程中的作用. 方法：应用免疫组化（SP法）和Western Blot，检测TSLC1蛋白在50例原发性肝癌组织中的表达情况，对肝癌患者进行临床病理学分期，检测肝癌患者HBV感染情况及血清中AFP水平. 结果：TSLC1蛋白在原发性肝癌组织中的阳性率及其评分为17／50(34％)，明显低于癌旁组织36／50(72％) (P&<0.01)；TSLC1蛋白的表达与原发性肝癌组织的临床分期、HBV感染及血清中AFP水平呈负相关，与肿瘤直径无关. 结论：TSLC1蛋白在原发性肝癌组织的发生、发展中可能起抑制作用，其表达可能与原发性肝癌的浸润、转移等有关.
【关键词】 肺癌肿瘤抑制物1 癌 肝细胞 免疫组织化学 Western Blot
　　 0引言
　　肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)是人类常见的恶性肿瘤，在肝癌的发生、发展过程中，研究新的抑癌基因对其产生的作用及引起的生物学特性的改变，对于补充阐明肝癌发病机制，指导临床治疗具有重要意义［1-3］. 近年来国内外关于抑癌基因肺癌肿瘤抑制物1(tumor suppressor in lung cancer 1， TSLC1)的研究报道已经涉及肺癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤组织［4-7］，但在肝脏肿瘤中表达情况的报道尚少，我们应用免疫组织化学(SP法)和Western Blot检测HCC及其相应癌旁肝组织、正常肝组织中TSLC1蛋白的表达情况，探讨其在HCC发生、发展中的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料收集2005～2007年在郑州大学第一附属医院普通外科手术切除的原发性肝癌标本50（男39，女11）例，平均年龄45（37～65）岁，患者手术前未经任何抗癌治疗. 每例标本均包括肝癌组织及距肿瘤边缘≤2 cm的癌旁非癌肝组织. 取材标本经分装后将用于免疫组化检测的标本行甲醛固定，Western Blot检测的标本行液氮保存，记录患者病历号，由病理科医师进行诊断和病理分级. TSLC1兔多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；Actin鼠抗兔 mAb（美国Sigma公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；半干电转印仪(美国CPL公司).
　　1.2方法
　　1.2.1免疫组化检测将标本经甲醛固定、脱水、常规石蜡包埋，制备4 μm连续切片，将石蜡切片65℃烘烤、脱蜡，30 mL/L过氧化氢灭活内源性过氧化物酶5 min，微波修复抗原，加一抗4℃湿盒中过夜，加生物素化二抗37℃反应30 min，以辣根过氧化物酶标记亲合素37℃处理30 min，冲洗后加二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水、封片后在光镜下观察. 结果判断：凡细胞质中出现明显的棕黄色颗粒者为阳性细胞. 根据切片中阳性细胞率及反应程度：细胞不着色或阳性细胞率&<25％者记为阴性(-)；阳性细胞率在26％～50％者记为弱阳性(+)；阳性细胞率在51％～75％者记为阳性()；阳性细胞率＞75％者记为强阳性(). 由两名病理科医师采用双盲法阅片，采用半定量法进行评分.
　　1.2.2Western Blot检测将标本在手术离体后立即去掉坏死组织、血块，于30 min内迅速投入-70℃液氮冻存. ①组织蛋白提取：取新鲜标本各100 mg，抽提全蛋白，测浓度后-70℃冻存备用. ②检测TSLC1蛋白：先后灌制100 g/L和40 g/L的SDS聚丙烯酰胺分离胶和积层胶，加Tris甘氨酸电泳缓冲液后，拔去梳子加样. 每孔加样25 μL，最后一泳道加入预染的低分子质量标准分子质量蛋白. 起始电压8 V/cm，样品进入分离胶后提至15 V/cm. 电泳完毕后用将蛋白转印于NC膜上，脱脂奶粉封闭膜后加入含一抗兔抗人TSLC1多克隆抗体(1∶200)的TBST，4℃过夜；洗膜，加的二抗(1∶2000，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，反应1 h. 洗膜后加入DAB显色. 蛋白的检测均以PBS替代一抗作为阴性对照，以Actin作为阳性对照.
　　统计学处理: 所有数值均采用x±s表示，应用SPSS 10.0分析软件，采用χ2检验进行统计处理，显著性检验水准取α=0.05.
　　2结果
　　2.1TSLC1蛋白在HCC及癌旁组织中的表达TSLC1蛋白阳性反应主要定位于胞质内，为胞质内棕黄色颗粒状或斑片状染色，部分阳性表达出现在胞膜，特别是细胞与细胞的交界处. 50例HCC组织中TSLC1蛋白阳性表达17例(34％，图1) 其中12例同时见汇管区或纤维间隔中少量单核性细胞呈弱阳性表达(+)，另有5例仅在汇管区或纤维间隔的单核性细胞内见弱或中等强度表达(). 而在50例癌旁组织中阳性表达36例(72％，图2)， 强阳性()17例，阳性()11例，弱阳性(+)8例，阴性(-)14例. HCC的阳性表达明显低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P&<0.01). 空白对照片均未见阳性表达.图1TSLC1蛋白在肝细胞癌组织中的弱阳性表达DAB ×400
　　图2TSLC1蛋白在肝细胞癌旁组织中的阳性表达DAB ×400
　　2.2TSLC1蛋白在HCC及癌旁组织中的表达与HCC临床病理特征的关系TSLC1基因在无多发病灶和血管癌栓或有完整包膜肝癌病例中的表达明显高于多发病灶和血管癌栓的肝癌或无完整包膜肝癌病例(P&<0.05及P&<0.01). 而在不同大小的原发性肝癌中，TSLC1蛋白的表达无显著性差异（表1）. TSLC1蛋白表达缺失的33例HCC标本有27例呈HBsAg阳性，而HBsAg阴性者仅3例TSLC1蛋白缺失，统计分析有显著相关性(P&<0.05). 以AFP=400 g/L为标准，在AFP值≥400 μg/L的32例患者中，HCC标本中TSLC1蛋白表达为8例；＜400 μg/L的18例患者中，HCC标本中TSLC1蛋白表达为9例. 表明TSLC1基因表达与血清AFP值呈负相关，统计分析有显著相关性(P&<0.05).
　　2.3Western Blot以标准蛋白Actin为参照进行统计分析，HCC组织50例中有5例未表达，蛋白的灰度扫描值平均为0.137±0.106；癌旁组织50例中，蛋白的灰度扫描值平均为0.405±0.233.表1TSLC1表达与肝癌临床病理学特征的关系

转贴于 3讨论
　　TSLCl为一种新发现的重要肿瘤抑制基因，研究认为其与多种肿瘤的发生有着密切的关系［8-9］. 我们用免疫组化和Western Blot检测到50例原发性肝癌中TSLC1蛋白的表达率低（34%），而在相应的癌旁非癌肝组织中TSLC1蛋白的表达率较高（72%），两者存在较大的差异，因而推测在原发性肝癌中，TSLC1蛋白的失表达可能是肝癌的发生机制之一. 我们发现在有无多发病灶和血管癌栓及有无完整包膜的肝癌中，TSLC1蛋白表达有显著性差异(P&<0.01)，表明TSLC1蛋白可能与肝细胞癌的侵袭和转移有关. TSLC1蛋白在AFP阳性HCC中的表达显著低于AFP阴性HCC组织，两者差异有显著性(P&<0.05)；合并HBsAg阳性的HCC中明显低于HbsAg阴性HCC组，两者差异具有非常显著性(P&<0.01)，提示在HCC的发生、发展过程中HBV与TSLC1蛋白可能有协同致癌作用. TSLC1在不同大小的肝癌中的表达差异无统计学意义. 在本实验中，与SP法相比Western Blot更为灵敏的检测到微量TSLC1的存在，而SP法能够直观的观察到TSLC1在细胞中的定位. 我们从定性、 定位及定量等方面同步检测了TSLC1蛋白在HCC、 癌旁的表达情况， 结果表明， 抑癌基因TSLC1的失活可能与HCC密切相关， 特别是其在HCC的发生、 发展以及肿瘤浸润、 转移的过程中可能起着重要作用， 有望成为肿瘤诊断、 恶性进展及预后判断的有效指标， 并为HCC的基因治疗提供理想靶点.

参考文献

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