关于HBV源性MicroRNA前体分子预测

【摘要】 目的： 预测HBV基因编码的microRNA分子前体. 方法： 采用VMir软件，对HBV全基因进行扫描，通过对所得序列的评分及结构分析，得到HBV编码的microRNA的候选前体分子；通过Northern blot实验，对预测结果进行初步验证. 结果： 通过VMir的预测，得到3个HBV可能编码的microRNA分子前体，即MD6，MD20，MR31；通过Northern blot实验，只有针对于MD17的探针杂交后出现特异性条带. 结论： MD17可能为HBV基因组编码的microRNA前体分子.
【关键词】 肝炎病素 乙型 微RNAs 预测

　　0引言
　　MicroRNA是一类21～23 nt长的非编码单链小分子RNA，是由priRNA分子经过剪切成为70～90个碱基大小、具有发卡结构单链RNA的前体（premiRNA），再经Dicer酶加工生成［1］. MicroRNA广泛存在于真核生物中，迄今为止在人体中已经发现了至少320种MicroRNA分子. MicroRNA通过与mRNA的3′非编码区相互作用调控基因表达，在机体的生理及病理过程中发挥重要作用. 最近研究表明，一些病毒的基因组，如疱疹病毒、腺病毒、HIV，也能编码MicroRNA［2］. HBV基因组能否编码MicroRNA分子目前还不清楚. 本研究中，我们借助于预测软件VMir，对HBV全基因组进行正反两个方向的扫描，寻找HBV基因中编码microRNA前体分子，对HBV编码的microRNA分子进行初步预测，并通过Northern blot实验对其进行初步鉴定.
　　1材料和方法
　　1.1材料预测软件VMir由加利福尼亚大学Grundhoff AT教授惠赠. HBV全基因序列检索自Genebank，序列号为NC_003977，adr型. HepG2和HepG2.2.15细胞均购自ATCC. HepG2细胞培养选用含100 mL/L胎牛血清（Hyclone）RPMI 1640培养液（Gibco）. HepG2.2.15细胞选用含相同血清浓度的培养液，另外加入终浓度380 mg/L的G418 (Sigma). 上述两种细胞均在37℃的含50 mL/L CO2孵箱中培养. Trizol购自Invitrogen公司. Northen blot所用尼龙膜购自Ambion公司. ［γ32P］ ATP购自北京福瑞生物工程公司.
　　1.2方法
　　1.2.1预测软件VMir工作原理VMir是由Grundhoff AT等［3-4］创建的一种病毒编码MicroRNA前体分子预测方法. 工作原理为：病毒基因序列以500 nt为一个窗口，10 nt递进扫描；RNAfold算法预测窗口内的发卡结构；限定发卡结构长度，按照以下规则评分：每个互补的碱基对奖励2分；末端环状结构超过17个碱基时，每超一个，减1分；对于对称性隆起，减去碱基数×1(碱基数≤4)或碱基数×1.5(碱基数﹥4) ；对于非对称性隆起，减去碱基数×2. 经上述处理，每个发卡结构得到一基数，再乘以系数Ip得到最终分值. 再进一步限定分值及其窗口出现频率（一般限定最低分值为115，窗口值即在不同窗口中出现的频率为35，因在该条件下成功预测概率为98%［4］），最终得到病毒基因编码的microRNA前体分子. 该方法已经成功预测出KSHV（卡普西肉瘤相关病毒）、EBV（EB病毒）等编码的microRNA前体分子.
　　1.2.2利用VMir预测HBV编码的microRNA前体分子将HBV全基因序列(NC_003977)导入VMir软件，设定窗口大小为500 nt，递进单位为10 nt，发卡结构长度设为100 nt，对HBV基因组中能够形成发卡结构的序列进行初筛. 然后，设定以每个序列最低得分为115，其窗口值最低为35，得到HBV可能编码的microRNA前体分子.
　　1.2.3预测前体分子的初步验证我们选用Northern blot方法对经VMir软件筛选到的候选分子进行初步验证. 所用探针序列为候选microRNA分子的反相互补序列，用T4多聚核苷酸激酶末端标记放射性标记γ32P. 以稳定表达HBV的HepG2.2.15为研究对象，以HepG2细胞作为对照，按照试剂说明书，利用Trizol试剂提取总RNA. 取40 μg总RNA进行150 g/L TBE尿素凝胶电泳；再经半干转运至尼龙膜后，利用上述标记探针杂交、放射自显影. 如果经VMir预测到的候选分子是HBV基因编码的microRNA前体分子，那么来自于HepG2.2.15细胞的总RNA与探针杂交后，应出现两条特异性的条带：分子量较大的一条为microRNA前体分子，较小的一条为成熟的microRNA分子. 因为microRNA前体分子在Dicer酶作用下产生成熟的microRNA分子，而剩余的核苷酸将迅速被降解，故一般只有两条特异性条带. 而来源于HepG2细胞的总RNA与探针杂交后则没有特异性条带产生.
　　2结果
　　2.1HBV基因组中microRNA前体分子预测将HBV基因序列导入VMir软件后，设定窗口大小为500 nt，以10 nt为递进单位，寻找HBV基因中的发卡结构序列. 共查找到56个寡核苷酸分子，其中在正向序列中有25条（MD1～25），反向序列31条（MR1～31）. 然后分别设定窗口值和最低分值为35和115，筛选出HBV最有可能编码的microRNA分子前体序列，最终得到了三个候选分子，即MD6， MD17和MR31(表1). 上述3个序列经RNAfold程序分析，得到二级结构（图1），表明这三条序列能形成典型的发卡样结构. 总之，从这三条序列的评分、窗口值及其二级结构，都提示他们可能是HBV基因组编码的microRNA前体分子；提示HBV同EBV， KSHV相似，也可能编制病毒来源的microRNA分子. 表1 HBV基因组中的候选
　　2.2microRNA前体分子的初步验证为了进一步证实MD6，MD17和MR31三个候选分子是否为HBV基因组编码的microRNA前体分子. 我们分别以MD6， MD17和MR31的反向互补的核苷酸序列，即TGGTAATAGAG GTAAAAAGGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGGCCCCCAATACCACATCATCCA，TCAA TGTCCATGCCCCAAAGCCACCCAAGGCACAGCTTGGAGGCTTGAACAGTAGGACATGAA CATGA和CCTCCTTTCCTCACATTCATTTACAGGAGGACATTATTAATAGATGTCAACAAT ATGTGGGCCCTCTGACAGTTAATGAAAAAAGGAGA作为探针，末端标记γ32P放射标记，分别HepG2细胞和稳定表达HBV病毒颗粒HepG2.2.15细胞的总RNA为杂交模板进行Northern blot实验. HepG2.2.15细胞总RNA只有与MD17互补的探针杂交后产生两条特异性的条带（图1C），而与MD6（图1A）和MR31（图1B）互补的探针杂交则没有特异性条带产生. 因此，提示MD17(TCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGC TGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGA)可能为HBV基因编码的miroRNA前体分子.
　　3讨论
　　microRNAs是一类非编码的小RNA分子，长度约为21～23 nt. 已经被鉴定的microRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5′端磷酸基和3′羟基，定位于RNA前体的3′端或者5′端. 自从第一个miRNA (lin4和let7)分子在线虫中发现［5］，迄今为止在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出的microRNA数量已超过3500个［6］. microRNA通过与mRNA的3′非编码区的相互作用，参与基因的表达调控，在人类基因中至少有1/3受microRNAs调控，在生理和病理过程中均具有重要作用［7-8］.

　　同其人类、果蝇、植物等多种生物物种一样，许多类似于HBV的DNA病毒也能编码病毒基因组来源microRNAs，如疱疹病毒家族的非洲淋巴细胞瘤病毒、卡波济肉瘤相关疱疹病毒、人巨细胞病毒，多瘤病毒属的肉瘤病毒40、鼠多瘤病毒，均能编码病毒特异性的microRNAs分子；这些病毒编码的microRNAs分子通过调控宿主细胞中或病毒本身特定基因的表达，使宿主细胞内环境的有利于病毒的复制、传播，有利于病毒逃逸宿主的免疫系统，最终达到保护自己的目的［9-10］.
　　鉴于病毒编码的microRNAs在病毒生活周期中的重要意义，在某种程度上我们可以推测，HBV作为一种常见的影响人类健康的致病病毒，也可能编码自己的microRNAs分子. VMir是由Grundhoff AT等研发的一种用来预测病毒编码microRNAs的软件，他们已经通过大量实验证实该软件可以有效地预测病毒编码的microRNA前体分子，进而达到预测病毒编码microRNA分子的目的. 我们借助该预测软件，对HBV的基因进行扫描，以期得到HBV编码的microRNA前体分子. 经过筛选，最终我们得到了3条候选核苷酸序列，即MD6， MD17和MR31. 这3条寡核苷酸分子无论从其评分还是结构都符合microRNA前体分子的条件. 然后，我们分别以MD6，MD17和MR31的反向互补序列为探针，与HepG2.2.15细胞的总RNA杂交，以HepG2细胞的总RNA为阴性对照，进行Northern Blot实验. 结果提示，只有MD17特异性探针有两条特异性条带产生，因此提示MD17很有可能就是HBV编码microRNAs的前体分子. 在后续的实验中，我们将通过Northern blot， RNA酶保护实验等手段来进一步验证MD17分子，并在此基础上找到其编码的成熟microRNAs分子.

【参考文献】
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［4］ Grundhoff AT， Sullivan CS， Ganem D. A combined computational and microarraybased approach identifies novel microRNAs encoded by human gammaherpesviruses ［J］. RNA， 2006，12(5):733-750.

［5］ Lau NC， Lim LP， Weinstein EG， et al. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans ［J］. Science， 2001，294(4):858-862.

［6］ GriffithsJones S， Grocock RJ， van Dongen S， et al. miRBase: microRNA sequences， targets and gene nomenclature ［J］. Nucleic Acids Res， 2006，34(1):140-144.

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［9］ Dykxhoorn DM. MicroRNAs in viral replication and pathogenesis ［J］. DNA Cell Biol， 2007，26(4):239-249.

［10］ Sullivan CS， Grundhoff A， Tevethia S， et al. Expression and function of microRNAs in viruses great and small ［J］. Cold Spring Harb Symp Quant Biol， 2006，71:351-356.