关于胆碱受体激动剂对谷氨酸诱导小胶质细胞增殖的影响

【摘要】 目的： 观察尼古丁及卡巴胆碱对谷氨酸诱导的小胶质细胞增殖的影响. 方法： 培养的小胶质细胞系，加入不同浓度的尼古丁、卡巴胆碱及谷氨酸，用MTT方法检测细胞活性，观察对小胶质细胞数量的变化. 结果： 培养的小胶质细胞提示，尼古丁及卡巴胆碱显著减少谷氨酸诱导小胶质细胞数量的增多，有剂量依赖效应，10 μmol/L浓度效果最为显著. 结论： 尼古丁及卡巴胆碱可显著抑制谷氨酸诱导小胶质细胞活化的增殖.
【关键词】 胆碱能激动剂 谷氨酸 小神经胶质细胞 细胞增殖
　　 0引言
　　谷氨酸的兴奋毒性是急性神经损伤（包括外伤性脑病、中风及阿尔茨海默病、多发性硬化等神经退变性疾病）的重要致病因素［1］，兴奋毒的关键是谷氨酸受体的过度激活，然而，因为阻断神经元的谷氨酸受体仍然能发生兴奋毒作用，可能有非神经元类细胞间接参与谷氨酸的兴奋毒过程［2］. 研究表明小胶质细胞介导的炎症，在阿耳茨海默病、帕金森病及脑中风等进行性神经元死亡中起重要作用. 谷氨酸能有效刺激小胶质细胞发生炎性增殖［3］. 迷走神经系统通过a7N型乙酰胆碱受体抑制巨噬细胞介导的系统炎症反应，称之为“胆碱抗炎通路”［4］. 小胶质细胞膜上表达a7N型乙酰胆碱受体，尼古丁可通过此受体调控小胶质细胞分泌炎性介质［5-6］，在胚胎发育过程的来源上脑组织内的小胶质细胞与外周巨噬细胞是一致的. 我们探索尼古丁及卡巴胆碱是否抑制谷氨酸诱导的小胶质细胞活化增殖.
　　1材料和方法
　　1.1材料Nicotine(Sigma)， Carbachol(Sigma)， Glutamate(Sigma)， DMEM (GIBCO)， Fetal Bovine Serum (HYCLONE)，MTT Solution (sigma)， DMSO (sigma). BV2小胶质细胞系购自北京协和医科大学细胞中心. 超净工作台(苏净安泰)，倒置荧光显微镜(日本Olympus TH4200)， CO2培养箱 (美国Forma 3111)，离心机(上海802B)，倒置显微镜(日本Olympus IX700)，酶标仪（美国Biotek）.
　　1.2方法小胶质细胞系传代后，按2.5×105个细胞/cm2密度种植在96孔板，培养第2天，小胶质细胞适应条件后，观察细胞生长良好的细胞开始加药，加谷氨酸500 μmol/L，30 min后加入不同浓度尼古丁或卡巴胆碱，24 h后检测不同剂量尼古丁或卡巴胆碱对谷氨酸诱导小胶质细胞增殖情况的影响. MTT法检测细胞活性. 噻唑蓝(MTT)可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲眃颗粒(formazan)，且甲眃生成量与活细胞数量及细胞活化状态呈线性关系. 检测前在培养液中加入MTT使之终浓度为500 μmol/L，置于CO2孵箱内，3 h后，去除培养液，加入DMSO震荡均匀，室温10 min左右，酶标仪测定570 nm波长的A值. 以正常对照组培养物A值作为100%，处理组培养物A值占对照组A值的比值反映细胞存活情况.
　　统计学处理： 各组数据应用SPSS 10.0统计软件进行分析. 实验数据以x±s表示，计量资料组间比较在确定方差齐性（P&>0.05）后，各组间比较采用One way ANOVA方差分析及LSD法，如果方差不齐则用非参数秩和检验. P&<0.05为具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1尼古丁减少谷氨酸诱导的小胶质细胞增殖96孔细胞培养板培养的小胶质系（BV2）细胞，加入谷氨酸500 μmol/L和不同浓度尼古丁24 h进行MTT检测，发现与对照组相比较，小胶质细胞数目在谷氨酸刺激下显著增多，为对照组的(247±36)%，小胶质细胞数目随着尼古丁剂量的增大而减少，尼古丁浓度10 nmol/L时，开始出现显著效应，至10 μmol/L时，数目减少最为显著；至100 μmol/L时，数目减少基本平稳（图1，2）.
　　2.2卡巴胆碱减少谷氨酸诱导的小胶质细胞增殖96孔细胞培养板培养的小胶质系细胞，加入谷氨酸500 μmol/L和不同浓度卡巴胆碱24 h进行MTT检测，发现与对照组相比较，小胶质细胞数目在谷氨酸刺激下增多，为对照组的(236±32)%，小胶质细胞数目随着卡巴胆碱剂量的增大而减少，卡巴胆碱浓度10 nmol/L时，开始出现显著效应，至10 μmol/L时，数目减少最为显著；至100 μmol/L时，数目减少基本平稳 （图3）.
　　3讨论
　　本实验结果提示尼古丁或卡巴胆碱显著抑制谷氨酸诱导的小胶质细胞增殖. 谷氨酸可以有效刺激小胶质细胞增殖，其刺激程度与以往的研究结果相一致［3］，尼古丁抑制谷氨酸引起的小胶质细胞增多，并存在剂量依赖效应，10 μmol/L浓度为最为显效.
　　炎症和兴奋毒（尤其在神经元损伤或死亡时释放的谷氨酸兴奋毒）是脑损伤及脑病包括中风和阿耳茨海默病等的两个主要特征［7-8］. 在哺乳动物和人，活化的小胶质细胞聚集在损伤的脑区周围［9］. 增殖和抑制凋亡是维持小胶质细胞正常功能所需要的. 尽管小胶质细胞有神经保护作用，但也有很多证据提示在神经系统疾病中，活化的小胶质细胞起到负面的破坏效应［10］. 在病理状态下，比如自身免疫和过度炎症反应时，抑制小胶质细胞的增殖功能将是有益的.

转贴于 在内毒素血症和休克动物模型中，副交感传出神经系统通过释放乙酰胆碱可以减轻巨噬细胞介导的系统炎症反应，在内毒素血症可以显著减少组织巨噬细胞生成肿瘤坏死因子，降低血清肿瘤坏死因子的水平，阻止低血压的发展［11］. 脑组织内的小胶质细胞在发育过程的胚胎来源上与外周巨噬细胞是一致的. 有研究者发现，在小胶质细胞上存在有功能的α7n型乙酰胆碱受体，乙酰胆碱受体激动剂可以调节小胶质细胞分泌一些炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子［5］和环氧化酶2、前列腺素E2等［6］. 本实验结果显示尼古丁或卡巴胆碱显著抑制谷氨酸诱导的小胶质细胞增殖，具有剂量依赖性. 为中枢炎症参与脑中风及神经退变性疾病等脑病的临床药物的研究提供了新思路和新的治疗靶点.
【

参考文献

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