关于Hsp70,Toll样受体4抗体与自身免疫性内耳病的关系

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【摘要】 目的： 建立一种自身免疫性内耳病的动物模型，寻求Toll样受体4抗体与Hsp70的关系. 方法： 提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原. 将豚鼠用环磷酰胺预处理，将抗原与等量弗氏完全佐剂一起免疫豚鼠，观测Hsp70在内耳的表达；通过鼓室注射Toll样受体4抗体，再观测Hsp70在内耳的表达. 结果： 免疫豚鼠后听性脑干反应阈显著提高，内耳出现显著的炎细胞浸润，Hsp70的表达增强， TNFα， NFκB的表达增多，血清中检测到抗Hsp70抗体；加入Toll样受体4抗体后Hsp70的表达减弱，炎细胞减少，TNFα， NFκB的表达降低. 结论： Toll样受体4抗体可下调Hsp70在自身免疫性内耳病中的表达.
【关键词】 热休克蛋白70 抗体 自身免疫疾病 耳蜗 豚鼠

　　 0引言
　　有研究表明Toll样受体4（Tolllike receptor 4， TLR4）可能介导热休克蛋白70（Hsp70）的信号传导，Hsp70是TLR4的内源性配体［1］. 我们以同种异体内耳组织为抗原免疫豚鼠，建立一种高阳性率听力损害的自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease， AIED）的动物模型，在鼓室注射Toll样受体4阻断剂即Toll样受体4抗体前后，观察模型动物耳蜗组织中的Hsp70表达情况.
　　1材料和方法
　　1.1材料耳廓反射正常、无中耳感染、体质量250～400 g的健康、白色、短毛、红目豚鼠75只，雌雄不拘（重庆医科大学动物实验中心）. 其中25只用于提制内耳抗原，其余50只随机分为实验组［20只，给予环磷酰胺（CTX）和粗制内耳抗原接种处理］；处理组（10只，给予CTX和粗制内耳抗原接种处理后施加干预因素Toll样受体4抗体）；对照1组（10只，只给予CTX预处理）；对照2组（10只，不施加任何因素），分笼后适应性喂养1 wk. TLR4 Ab［FG Purified antihuman TLR4（HTA125），美国eBioscience公司］；苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天生物技术研究所）；鼠抗Hsp70 mAb、弗氏完全佐剂(CFA)（美国Sigma公司），大鼠抗核因子кB（p65）mAb（Santa Cruz公司），均由北京中山公司分装；TNFα ELISA试剂盒（晶美公司）；抑肽酶、DAB 显色系列购自北京中山公司；CTX购自重庆医科大学附属一院药房.
　　1.2方法
　　1.2.1内耳抗原的提制豚鼠25只，用速眠新0.1 mL/kg肌肉注射麻醉后断头处死，参照文献［2］的方法提制粗制内耳抗原液，用酶标仪检测内耳抗原液浓度，并在-70℃分装保存备用.
　　1.2.2免疫动物将实验组豚鼠腹腔注射CTX(150 mg/kg)进行预处理，2 d后对每只豚鼠用粗制内耳抗原液与弗氏完全佐剂等量乳化液400 μg粗制内耳抗原蛋白量共0.2 mL进行颈、背部、足部皮内多点注射接种［2］. 处理组按实验组的方法免疫豚鼠，2 d后每只豚鼠经鼓室注射TLR4阻断剂100 μg.
　　1.2.3内耳石蜡切片的制作将动物麻醉后快速断头，取出听泡，经40 mg/L多聚甲醛固定， 100 mg/L EDTANa2脱钙后，OCT包埋标本，沿耳蜗中轴切片，片厚5 μm.
　　1.2.4检测指标
　　1.2.4.1听性脑干反应（ABR）测试所有动物在免疫前均行ABR测试，实验组动物免疫后1 wk，处理组于处理因素后1 wk，对照组在处死前均再接受ABR测试. 豚鼠麻醉后，在静电屏蔽室内行双侧ABR测试，短声刺激，扫描周期10 ms，滤波带宽100～300 Hz，信号叠加1000次，以ABR波Ⅲ反应阈为标准判断听阈.
　　1.2.4.2豚鼠耳蜗Hsp70的表达取实验组动物听阈超过10 dB的10耳，并随机选取处理组和对照组的10耳，耳蜗切片做免疫组化染色（SABC法）. 切片用0.3 mL/L甲醇h3O2液处理；山羊血清封闭；加一抗（鼠抗Hsp70 mAb 1∶100）37℃孵育1 h，并用普通小鼠IgG(1∶100)取代一抗作阴性对照；滴加二抗（生物素化羊抗小鼠IgG，即用型）在37℃反应30 min；二氨基联苯胺（DAB）显色，常规脱水、透明、中性树胶封片. 胞核及胞质呈棕黄色染色为阳性. 在上述各组的切片中，每耳分别随机抽出1张近中轴的切片，做统计学分析. 每张切片随机选取10个视野计数300个螺旋神经节细胞，依照阳性细胞百分比判断，阳性率&<10%(-)、阳性率10%~25%(+)、阳性率26%~50%()、阳性率&>50%().
　　1.2.4.3耳蜗中NFκB（p65）的表达用SABC法，方法及结果判定同上，以缓冲液代替一抗作阴性对照.
　　1.2.4.4内耳TNFα的表达用ELISA夹心法，应用豚鼠TNFαELISA试剂盒，严格按照产品说明进行操作，酶标仪检测A值，得出标准曲线，求出各浓度值.
　　1.2.4.5血清中抗Hsp70抗体的测定取实验组听阈提高&>10 dB的和对照组的动物血清，滴加豚鼠血清IgG，发生凝集反应为阳性.
　　统计学处理： 数据输入SPSS10.0统计软件，所有实验组均进行正态性检验和方差齐性分析，多个样本均数的比较用单因素方差分析，均数两两比较用StudentNewKeulsq检验.
　　2结果
　　2.1ABR测定在动物接种后7 d，实验组40耳中波Ⅲ反应阈34耳提高≥10 dB，6耳提高&<10 dB，听阈提高率为85%. 其中听阈提高10 dB者18耳，15 dB者10耳，20 dB者4耳，25及40 dB者各1耳. 阈值为（75.8±15.0）dB声压级，与正常对照组比较有统计学差异（P&<0.01）;正常对照1组和2组7 d时听阈提高≥10 dB 者为0耳，ABR阈值分别为（55.1±3.7），（54.2±4.8） dB声压级，两组间无统计学差异；处理组7 d后听阈降低10 dB 者有10耳，ABR阈值为（60.1±6.2） dB声压级，与实验组间有统计学差异（P&<0.05），与对照组间无统计学差异（P&>0.05）.
　　2.2耳蜗中Hsp70表达实验组耳蜗螺旋韧带和血管纹呈棕黄色的强阳性染色，对照组呈弱阳性染色，两者之间有统计学意义（P&<0.01，表1），而对照组间无统计学差异（P&>0.05）；处理组的染色呈弱阳性，与实验组有统计学意义（P&<0.05），与对照组无统计学差异（P&>0.05）.表1各组耳蜗中Hsp70样蛋白的表达情况
　　2.3耳蜗NFκB（p65）的表达实验组NFκB（p65）在耳蜗螺旋韧带和内淋巴囊呈棕黄色的强阳性染色，对照组呈弱阳性染色，两者之间有统计学意义（P&<0.01），而对照组间无统计学差异（P&>0.05）；处理组的染色呈弱阳性，与实验组有统计学意义（P&<0.05），与对照组无统计学差异（P&>0.05）.

2.4TNFα的表达实验组耳蜗组织提取液中TNFα浓度增加，与对照组比较有统计学意义（P&<0.05，表2）；处理组中TNFα浓度表达降低，与实验组比较有统计学差异（P&<0.05），而与对照组比较无统计学意义（P&>0.05）；对照组间无统计学差异（P&>0.05）.
　　2.5血清中抗Hsp70抗体的测定实验组动物血清出现抗原抗体凝集反应. 表2各组豚鼠内耳组织提取液中TNFα浓度
　　3讨论
　　热休克蛋白是生物进化最保守的伴随细胞蛋白，具有多种生物学活性功能，参与抗原提呈加工，协同免疫及自身免疫，与许多自身免疫有关. 作为其成员之一的Hsp70，在生物细胞中含量最高，诱导性最强，其主要生理功能是作为“分子伴侣”参与其他蛋白质的合成与成熟. 在大多数正常细胞中，Hsp70仅呈低水平表达［3］，但对在正常耳蜗是否存在Hsp70则有不同观点［4-5］.
　　Toll样受体是识别病原微生物的跨膜受体家族，最近有研究［6］提示，TLRs还能识别受损伤细胞或坏死细胞来源的内源性信号，证明Hsp是TLR信号转导途径中的内源性配体［7］，通过TLR介导的免疫应答参与炎症、肿瘤、自身免疫疾病的发病机制. 陈新忠等［1］认为Hsp70可能是TLR4的内源性配体，通过TLR4介导Hsp70信号传导，从而激活核转录因子NFκB，通过基因转录诱发一系列的病理生理改变，如TNFα的产生等，最终导致组织细胞的损伤.
　　我们建立了一种高阳性率听力损害的AIED动物模型，在实验组动物40只耳中，听阈提高&>10 dB的有34只耳，阳性率85%，可能与CTX的应用有直接关系. CTX是一种免疫抑制剂，推测使用它之后可能降低了动物的自身免疫监视作用. 在4组豚鼠中，对照组Hsp70在内耳呈低水平表达，在实验组听阈提高&>10 dB的34耳中，免疫组化结果提示Hsp70在动物耳蜗的表达呈明显增强的趋势，这可能是由于利用同种异体粗制膜迷路抗原全身免疫豚鼠之后，使其产生针对膜迷路的体液和（或）细胞免疫反应，当该反应发展到一定强度时，听功能下降，同时选择性激活细胞内的热休克基因，启动Hsp70大量合成. 实验组听阈提高&<10 dB的耳蜗的Hsp70表达水平与对照组相比并无显著性提高，其原因可能是内耳免疫强度尚为达到启动热休克基因的阈值，推测如果加大免疫强度可能会发生听功能下降. 实验组Hsp70表达阳性的耳蜗中，NFκB表达增加，TNFα的浓度亦增加，并且在血清中检测到抗Hsp70的抗体，而对照组则无变化；在处理组中，施加干预因素TLR4抗体后，内耳Hsp70的表达降低，NFκB减少，TNFα的浓度下降. 可能是TLR4抗体与TLR4结合后，抑制了Hsp70的信号传导，导致Hsp70表达下降，从而抑制了NFκB的活化，导致了TNFα的浓度下降. 本研究说明Toll样受体4抗体可下调Hsp70在自身免疫性内耳病中的表达.
【参考文献】
［1］ 陈新忠，孙宗全. 单核细胞Toll样受体4可能介导热休克蛋白70信号的转导［J］. 中华医学杂志，2005，85（7）:483.

［2］ 向明亮，吴皓. 环磷酰胺预处理后再免疫豚鼠听功能的变化［J］. 上海第二医科大学学报，2005，25（11）:1138-1140.

［3］ Burel C， Mezger V， Pinto M， et al. Mammalian heat shock protein families［J］. Exp Functions Experientia，1992，48(7):629-634.

［4］ Gower VC， Thompson AM. Localization of inducible heat shock protein mRNA in the guinea pig cochlea with a nonradioactive in situ hybridization technique［J］. Laryngoscope， 1997，107(2):228-232.

［5］ Myers MW， Quirk WS， Rizk SS， et al. Expression of the major mammalian stress protein in the rat cochlea following transient ischemia［J］. Laryngoscope，1992，102(9):981-987.

［6］ Gelman AE， Turka LA. Autoimmunity heats up［J］. Nat Med， 2003，9(12):1465-1466.

［7］ Akira S， Takeda K， Kaisho T. Tolllike receptors: Critical proteins linking innate and acquired immunity［J］. Nat Immunol， 2001，2(8):675-680.

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