关于5 氮胞苷诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化成肌细胞

【摘要】 目的： 观察并检测5氮胞苷（5Aza）诱导大鼠脂肪间充质干细胞(AMSCs)分化成肌细胞的过程中，细胞形态及相关基因、蛋白的表达情况，探讨5Aza对大鼠AMSCs分化的诱导作用. 方法： 分离大鼠AMSCs，在含有10 μmol/L 5Aza的培养液中培养，观察细胞形态的变化，并通过逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测诱导后MyoG的表达，免疫细胞化学染色法检测诱导后Desmin和αSarcometric Actin的表达. 结果： 用10 μmol/L 5Aza诱导后，细胞形态逐渐伸展变长，呈现肌细胞形态；RTPCR结果显示，诱导后15 h左右开始表达MyoG；免疫细胞化学染色结果显示，诱导10 d后Desmin染色呈弱阳性，14 d阳性程度增强，且此时部分细胞开始表达αsarcomeric Actin，并随时间延长表达增强，至28 d呈强阳性. 结论： 采用10 μmol/L 5Aza可以诱导大鼠AMSCs向肌细胞分化.
【关键词】 5氮胞苷 脂肪间充质干细胞 肌细胞
　　 0引言
　　脂肪间充质干细胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells， AMSCs)是继骨髓间充质细胞后发现的又一具有广阔应用前景的成体干细胞. 自2001年以来，国内外多个研究小组从不同物种分离出AMSCs［1-2］，并相继证实它具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经细胞和内皮样细胞等多种细胞分化的能力［1-5］. AMSCs可作为多种组织工程的种子细胞，为研究细胞定向分化提供了一个新的工具，其定向分化成肌细胞在有关肌损伤的治疗上具有重要的现实意义. 我们采用含有10 μmol/L 5Aza的培养液体外诱导大鼠AMSCs分化成肌，以期为AMSCs的应用提供理论依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料DMEM培养基（Gibco），I型胶原酶（Sigma），胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），Tripure Isolation Reagent（Roche Switzerland）， RTPCR 一步法试剂盒及DNAMarker(100~2000 bp)（TaKaRa Japan），鼠抗人CD14， CD34， CD44， CD105， CD106， S100和HLRDR mAb（北京中杉金桥生物技术有限公司），小鼠抗大鼠Desmin mAb，小鼠抗大鼠αSarcometric Actin mAb，SABC试剂盒及DAB显色剂（武汉博士德），20日龄雄性SD大鼠购于第四军医大学实验动物中心.
　　1.2方法
　　1.2.1大鼠AMSCs的分离培养根据本实验室建立的方法［6］，将大鼠断颈处死，并充分浸泡于750 mL/L乙醇中消毒10 min，取出，无菌条件下取脂肪垫，用含高浓度抗生素(青霉素3×105 U/L和链霉素3×105 U/L)的无血清培养基溶液清洗三次，将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，加入5 g/L I型胶原酶，置于恒温水浴振荡器中37℃振荡消化50 min，取出，加入与胶原酶等体积的含血清培养基中和消化，将组织悬液依次通过160目和600目筛网过滤，收集滤液，1300 r/min离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬细胞，室温静置10 min， 1300 r/min离心5 min，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，1500 r/min离心5 min，弃上清，向离心管内沉淀中加入含100 mL/L FBS的DMEM培养基，5×104/cm2密度接种. 37℃ 50 mL / L CO2培养箱中培养，24 h后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每隔48 h换液1次. 待细胞增殖至皿底面90%融合，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代.
　　1.2.2大鼠AMSCs鉴定选择生长良好的第五代细胞，用40 mL/L甲醛固定30 min，参照SABC试剂盒和DAB染色剂说明进行抗CD34， CD44， CD105， CD106和HLADR免疫细胞化学染色. 倒置显微镜观察并照相.
　　1.2.35Aza（10 μmol/L）诱导AMSCs成肌分化向DMEM完全培养基中加入5Aza至终浓度为10 μmol/L并使之完全溶解，配制成诱导培养基. 取传至第四代AMSCs，向培养皿内加入诱导培养基，24 h后去除诱导培养基，1×PBS洗涤2遍后更换DMEM完全培养基继续培养，每2 d换液1次.
　　1.2.4RTPCR检测MyoG的表达RTPCR分别检测未诱导及诱导后12， 15， 24， 48和72 h MyoG的表达. RNA提取和逆转录反应常规进行. RTPCR用两步法试剂盒，按操作程序进行，PCR反应条件为：94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，共33循环，最后72℃延伸10 min. MyoG上游引物：5′ CTACAGGCCTTGCTCAGCTC 3′，下游引物：5′ ACGATGGACGTAAGGGAGTG 3′，引物扩增片段为221 bp；βactin上游引物：5′ACTGCCGCATCCTCTTCCTC3′，下游引物：5′CTCCTGCTTGCTGATCCACATC3′，引物扩增片段为399 bp，由上海生物工程公司合成. 1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定 RTPCR 扩增产物.
　　1.2.5免疫细胞化学染色取诱导培养第7， 10， 14， 28日的细胞，以未加5Aza诱导的大鼠AMSCs做为对照组，参照SABC试剂盒和DAB染色剂说明进行抗Desmin和αSarcometric Actin免疫细胞化学染色. 倒置显微镜观察并照相.
　　2结果
　　2.1AMSCs的分离培养原代培养的细胞大鼠AMSCs 24 h内基本贴壁完全，贴壁细胞呈成纤维细胞样形态，为短梭形或三角形，少量为多角形，第3~5日生长速度明显加快，部分细胞呈集落样生长，至7~8 d细胞生长基本达到80%~90%融合. 传代细胞1~2 h即开始贴壁，12 h贴壁完全，细胞形态主要以梭形为主，生长速度较原代细胞快，5 d左右即可达到完全融合，细胞群生长具有一定方向性（图1A）. 经5Aza诱导后，细胞的形态开始发生变化：一些细胞由短梭形变为长梭形. 2 wk后，部分临近细胞相互融合，形成类似肌管样结构（图1B）.
　　2.2AMSCs 鉴定大鼠AMSCs能够表达间充质干细胞的表面标志CD44和CD105，而不表达造血干细胞的标志CD34和CD106，也不表达成纤维细胞表面标志HLADR(图2).
　　2.3RTPCR 扩增产物电泳AMSCs经10 μmol/L 5Aza诱导后15 h MyoG开始表达（图3）.
　　M: marker DL 2000; 1~5: 12， 15， 18， 24， 72 h; 6: 未经诱导的对照组.
　　图35Aza诱导后MyoG的表达
　　2.4免疫细胞化学染色取诱导后第7， 10， 14， 28日的细胞分别进行Desmin和αSarcometric Actin免疫组化染色，结果显示：10 μmol/L 5Aza诱导后10 d，部份AMSCs细胞开始表达 Desmin，至14 d阳性程度明显增强（图4 ）. 诱导后14 d，部份AMSCs细胞αsarcomeric actin呈阳性，随时间延长阳性增强，至28 d呈强阳性（图5）. 阴性对照为未诱导的大鼠AMSCs.

　　3讨论
　　脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞具有相似的生物学特性，都可作为组织工程细胞，但是骨髓的抽取往往给患者造成痛苦，且来源有限（在骨髓中其仅占有核细胞的1×10-4~1×10-3 ［7］）；而AMSCs具有易于大量获得（每250~500 mL脂肪中含有超过1×109个成体干细胞［8］），对供区的损伤小，体外增殖能力强等优点，是干细胞生物工程研究种子细胞的理想来源.
　　Zuk等采用酶消化法从大鼠脂肪组织中分离获得PLA （processed lipoaspirate）细胞群，我们对其方法略加改进，获得的AMSCs经多次传代后细胞形态均一，增殖速度较快，纯度较高. 研究证实，脊椎动物 DNA 的胞嘧啶残基甲基化与基因表达的调控有关［9］，在生物发育期，组织特异性基因可通过选择性的去甲基化而转化形成特异的细胞表达类型［10］.

转贴于 5Aza被广泛用于诱导基因表达和细胞分化，它通过掺入DNA阻止在新复制的DNA中的胞嘧啶发生甲基化，使原本处于转录失活阶段的相关基因得以激活和表达，但它对培养细胞和动物体本身也有很高的毒性作用，因此，我们根据国内外现有的多个相关实验结论和自身的实验条件摸索，选择10 μmol/L 5Aza 对AMSCs进行成肌诱导，实验中发现：AMSCs经成肌诱导培养后，倒置显微镜下观察其形状由短梭形或三角形转变为长梭形，细胞形态趋于均一. 随着培养时间的延长，部分相邻细胞开始融合，形成类似肌管样的细胞，而对照组细胞均未发现上述形态变化. 上述结果与国外一些学者研究AMSCs成肌分化的结果相一致［4］. 由此，可以从形态学上初步判断，经5Aza诱导的AMSCs已经向成肌方向分化. RTPCR检测结果显示成肌诱导后15 h AMSCs开始表达 MyoG，该基因的表达表明AMSCs已经向肌细胞分化. 免疫细胞化学染色结果显示： 10~28 d表达特异抗原Desmin和αsarcomeric actin，2 wk后有类似肌管样结构出现，与相关研究报道也相符［11］，提示AMSCs中的成肌相关基因被激活，使AMSCs向成肌方向分化.
　　种子细胞的来源是制约组织工程广泛应用的关键问题之一，AMSCs来源广泛，对供区损伤小，并且在体外易于培养，增殖速度快，是组织工程种子细胞的理想来源. 进一步探索干细胞分化成肌的条件及其分化机制， 必将为应用于临床治疗肌组织损伤等奠定基础.

参考文献

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