关于胰腺组织总蛋白分步提取法的建立

【摘要】 目的：通过对提取狗胰腺组织总蛋白不同方法的研究，建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法. 方法：用常规的总蛋白一步提取法和三步提取法，以三种溶解性能不同的裂解液分步提取胰腺组织中的总蛋白，测量蛋白浓度并分别用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionizationtime of flightmass spectra， MALDITOFMS)做蛋白全谱. 结果：一步法和分步法总蛋白提取量分别为(18.8±1.2) mg和(23.3±0.9) mg， MALDITOFMS蛋白全谱的谱峰数分别为(22.2±4.5)个和(32.8±3.8)个. 结论：分步法与常规的一步法相比具有蛋白提取率高、蛋白溶解性好等优点.
【关键词】 总蛋白 蛋白质组 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 提取
　　 0 引言
　　近年来，胰腺癌的发病率有逐年增多的趋势. 手术切除率虽然有所提高， 但5年生存率低于5%［1］. 提高生存率的关键是早期诊断，但现有的肿瘤标志物敏感性和特异性均不理想. 蛋白质组学（proteomics）的出现为寻找一种敏感性和特异性较高的肿瘤标志物带来了希望［2］. 由于蛋白质组研究相关技术体系建立时间较短， 目前仍存在许多有待改进之处， 特别是在蛋白质样品制备方面. 目前常用的组织总蛋白提取方法对于提取胰腺组织总蛋白存在一定缺陷，组织总蛋白质一步提取法在完全溶解组织总蛋白(特别是疏水蛋白质) 以及蛋白的分离效果等方面存在缺陷. 这些不足之处直接影响了蛋白质组分析结果的全面性和准确性. 我们尝试采用三步提取法［3］分步提取胰腺组织总蛋白， 并和常规的一步提取法相对比，旨在建立提取胰腺组织总蛋白的标准方法.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 健康杂种雄性犬1只，体质量15.5 kg（第四军医大学实验动物中心）. 尿素，硫脲，辛酰基硫代甘氨酸三甲内盐(SB310)，IPG buffer(pH310)均购自Sigma公司. 蛋白酶抑制剂(cock tail)，胰酶抑制剂，3［(3胆酰胺丙基二乙胺］丙磺酸(3［(3Cholamidopropyl)dimethylammonio］1propane sulfonate， CHAPS)，三氟乙酸(TFA)均购自Solarbio公司. Trisbase， 二硫苏糖醇(DTT，北京鼎国公司)；Bradford蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime公司）. VCX 130 PB超声破碎仪(美国Sonics公司)，低温超速离心机（美国Beckman公司），Ultrospec 1100 Pro紫外分光光度计(瑞典Amer sham公司)，MALDITOFMS质谱仪（ABI公司）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 标本采集 取狗的新鲜胰腺组织，1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗以去除血液和其他组织. 取同一部位的一块组织留作实验用，其余组织立即放入液氮中速冻后转存于-70℃冰箱.
　　1.2.2 总蛋白的一步提取 取0．3 g胰腺组织标本用预冷的1×PBS液冲洗去除血液和其他组织，在冰面上用眼科剪剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm小块并加入配置好的3 mL裂解液：7 mol／L尿素，2 mol／L硫脲，5 mL/L IPG buffer (pH 3～10)，65 mmol／L DTT，40 g/L CHAPS，5 mg/L蛋白酶抑制剂，10 mL/L胰酶抑制剂，混匀，在冰面上用超声粉碎. 4℃离心，120 000 g， 30 min，上清为蛋白提取物标记为A，冻存于-70℃冰箱中.
　　1.2.3 总蛋白的分步提取 第一步，取0.3 g胰腺组织用预冷的1×PBS液冲洗去除血液和其他组织，在冰面上用眼科剪剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm小块并加入1 mL裂解液I：40 mmol／L Trisbase (pH 8.1～8.3)，5 mg/L蛋白酶抑制剂，10 mL/L胰酶抑制剂，混匀，在冰面上用超声粉碎. 4℃离心，120 000 g， 30 min，取上清标记为B1，冻存于-70℃冰箱中. 第二步，在第一步沉淀离心管中加入1 mL裂解液Ⅱ：8 mol／L尿素，40 mmol／L Tris. 5 mL/L IPG buffer (pH 3～10)，65 mmol／L DTT. 40 g/L CHAPS，5 mg/L蛋白酶抑制剂，10 mL/L胰酶抑制剂. 混匀，超声粉碎、离心条件同前，取上清标记为B2， 冻存于-70℃冰箱中. 第三步，用1 mL裂解液Ⅲ：7 mmol／L尿素，2 mmol/L硫脲，20 g/L SB310，20 g/L CHAPS，5 mL/L IPG buffer，5 mg/L蛋白酶抑制剂，10 mL/L胰酶抑制剂，溶解第二步沉淀物. 再行超声粉碎，离心条件同前. 取上清标记为B3，冻存于-70℃冰箱中.
　　1.2.4 蛋白含量测定 按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒的操作步骤操作. 一步法和分步法所得到的总蛋白提取物分别测定总蛋白浓度，根据各自浓度计算出相应的总蛋白含量. 分步法中将计算出的各步提取的蛋白含量相加即为其最终提取出的总蛋白量.
　　1.2.5 质谱分析 将样品按1∶100稀释，取1 μL样品和1 μL基质用涡旋混合器充分混和均匀，点在不锈钢电样板上，置于空气中自然风干. 吸取1.5 μL含1 mL/L TFA的去离子水点到样品上3～5 s后，将溶液吸掉以去除样品中的盐分. 仪器分析条件参考文献［4］.
　　统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件行t检验，所有实验结果以x±s表示，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 蛋白浓度测定 一步法所得总蛋白量为（18.8±1.2 ） mg，分步法所得总蛋白量为（23.3±0.9） mg （n=5），两种方法提取的总蛋白量有显著性差异(t=6.4，P&<0.01). 分步法提取的总蛋白量高于一步法.
　　2．2 质谱分析 质谱图中以最强的离子峰（基峰）高为100％，其他峰的峰高用相对基峰的百分数表示. 不小于基峰5％的离子峰给出相应的质荷比值. 两种方法用同一胰腺组织重复提取5次，并在相同条件下制谱，除了细微的差别，两种方法均有良好的可重复性.
　　2.2.1 疏水性蛋白的溶解 一步法（图1）可观察到的谱峰数为（22.2±4.55）个，质荷比范围: 2012.20～7378.12 u. 分步法（图2）综合可观察到的谱峰数为（32.8±3.83）个，质荷比范围1859.59～9914.72 u. 两种提取方法MALDITOFMS分析蛋白谱峰数有显著差异(t=4.0， P&<0.01)，分步法蛋白谱峰数多于一步法. 分步法能够提取出更多的蛋白. 图2c中出现了质荷比7400 u以上的谱峰6个，而在图1中没有出现，说明第三步裂解中溶解了一步法所不能溶解的疏水性蛋白.
　　图1 一步法提取胰腺组织总蛋白基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图
　　2.2.2 总蛋白的溶解度 分别比较图1和图2中溶解蛋白的相对丰度，可见一步提取法在质荷比为2900，3400，4600，5200，6400，7400 u左右的蛋白相对丰度低于10％，而在分步提取法中以上各点处蛋白的相对丰度有了明显的提高.

3 讨论
　　蛋白样品制备是蛋白质组学研究过程中的首要步骤，其质量的好坏直接影响到最终结果. 对于复杂混合蛋白组分的研究最常用双相凝胶电泳（2DE）技术［5］. 但是2DE的缺点是难以分离疏水性膜蛋白和低丰度蛋白［6-7］，不易分离极酸和极碱、极大或极小的蛋白.质谱蛋白全谱分析能够在完整组织总蛋白提
　　A: 第一步提取； B: 第二步提取； C: 第三步提取.
　　图2 分步法提取胰腺组织总蛋白基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图
　　取物中识别出尽可能多的肽和蛋白混合物中的组分. 而且还可以提供准确的肽和蛋白质的相对分子量和丰度. 质谱技术非常灵敏，一般只需10～15 fmol蛋白就可得到满意的结果，因此更有利于检测出样品中的低丰度蛋白，而且具有良好的稳定性和重复性.
　　胰腺组织中含有丰富的酶类，大约有700种蛋白酶. 所以胰腺组织蛋白降解速度快不易保存. 目前常用的总蛋白一步提取法主要用于一般组织可溶性蛋白的研究，而对于疏水性蛋白溶解性差，并且造成疏水蛋白的较多丢失. 这些不足直接影响胰腺蛋白质组分析结果的全面性和准确性. 应用广谱蛋白酶抑制剂（cock tail配方），并加入胰蛋白酶抑制剂，采用分步提取法［3］用于胰腺组织蛋白质组学研究. 第一步用水溶液先溶解亲水性蛋白，第二步在第一步的沉淀中加入含有UreaCHAPSDTT的溶液进一步提取，第三步在第二步沉淀中加入对疏水性蛋白（如膜蛋白）有良好溶解作用的硫脲和SB310进一步溶解. 与常规一步法相比较，经MALDITOFMS结果证明，用分步法提取的蛋白质样品，可溶解更多的疏水性蛋白. 由于质谱分析中会产生“歧视”现象［8］，高丰度蛋白信号会抑制低丰度蛋白信号. 分步提取法从亲水性、等电点、分子质量三方面分离蛋白质并分别按照各自最佳条件制谱，防止了质谱分析中的“歧视”现象，提高了总蛋白中低丰度蛋白的相对丰度，最终得到更多的蛋白谱峰，增强了蛋白质的检出率. 分步法不但提高了分离效果，而且根据质谱提供的相对丰度和质荷比对蛋白质鉴别可提供更多的信息. 该方法的建立为进一步开展胰腺相关疾病的发生、发展的蛋白质组研究打下了良好的基础.

参考文献

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