关于双歧杆菌联合顺铂对黑色素瘤小鼠的治疗作用及机制

【摘要】 目的： 探讨双歧杆菌、顺铂及二者联合对黑色素瘤小鼠的抑瘤作用及其机制. 方法：建立黑色素瘤荷瘤小鼠模型，分别以皮下及腹腔注射双歧杆菌和顺铂，处死小鼠后测瘤质量计算抑瘤率，病理切片后HE染色观察瘤组织及瘤细胞变化，流式细胞仪测瘤细胞周期，MTT法测小鼠淋巴细胞活性，CD3，CD4，CD8双荧光标记法测小鼠T细胞亚群变化. 结果：注射1×1010 cfu/L的双歧杆菌其抑瘤率可达54.0％，与顺铂组相似，与顺铂联合作用后其抑瘤作用更强，达74.4％；病理切片显示双歧杆菌抑制瘤细胞生长，且加强了顺铂杀伤瘤细胞的作用；流式细胞仪检测结果显示：双歧杆菌作用后瘤细胞生长阻滞于G1期，顺铂作用后瘤细胞生长阻滞于S期；双歧杆菌作用后小鼠细胞免疫功能增强，主要表现为CD4+比例增加，与正常组比较差异有统计学意义(P&<0.01). 结论： 双歧杆菌联合顺铂对黑色素瘤小鼠具有较强的抑瘤作用，其机制与抑制瘤细胞生长及增强小鼠细胞免疫功能有关.
【关键词】 双歧杆菌 顺铂 荷瘤小鼠 抗肿瘤药
　　0 引言
　　恶性黑色素瘤是一种好发于皮肤的高度恶性肿瘤，其对放疗与化疗均不敏感，这给晚期恶性黑素瘤的治疗带来一定的困难， 双歧杆菌是一种生理性有益菌，且具有抗肿瘤作用［1-3］，但其对黑色素瘤的作用少见报道. 我们研究了双歧杆菌、顺铂及二者联合对黑色素瘤小鼠的抑瘤作用，观察了瘤组织及瘤细胞周期的变化、淋巴细胞增殖及T细胞亚群变化，旨在为双歧杆菌治疗恶性黑色素瘤提供新的理论依据.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 C57/6J小鼠，6～8 wk龄，雌雄不拘，体质量(16±2) g，中国科学院上海动物实验中心提供. 小鼠黑色素瘤B16细胞株，中国科学院上海细胞生物学研究所提供. 青春双歧杆菌菌苗(BF)由河南省医科院提供. 顺铂为山东齐鲁药业产品，批号0504015. MTT，PI，DMSO购自Sigma公司；CD3FITC， CD4PE， CD8PE荧光双标记mAb购自BD公司；RPMI1640培养基、胎牛血清为TBD公司产品; 全自动酶标仪（Thermo Wultiskan Ascent）；流式细胞仪（FACS Calibur ）；倒置显微镜（Axioskop 2 plus ）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 双歧杆菌的培养与计数 采用PYG培养基培养，pH 7.4的PBS洗涤3次，1500 g离心15 min，加1 mL PBS，混匀，85℃水浴15 min，细菌计数板计数. 双歧杆菌浓度：16×1013 cfu/L.
　　1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 B16肿瘤细胞传两代以上，调整细胞数至3×1010/L， 0.1 mL/只接种于小鼠右后肢皮下，共注射30只，其余为正常对照.
　　1.2.3 分组 共分为6组：接种瘤株24 h后的小鼠随机分成5组:Ⅰ组为生理盐水组（即肿瘤对照组），Ⅱ组为顺铂组，Ⅲ组为顺铂＋高剂量细菌组，Ⅳ组为高剂量细菌组，Ⅴ组为低剂量细菌组，Ⅵ组为未接种瘤细胞的正常对照组. 注射方法为隔日注射1次，生理盐水和顺铂为腹腔注射，0.2 mL/只，顺铂用量为4 mg/kg，细菌组为多点皮下注射，0.1 mL/只，Ⅳ组细菌浓度为1×1012 cfu/L，Ⅴ组细菌浓度为1×1010 cfu/L. 各组共注射7次，末次给药24 h后处死小鼠.
　　1.2.4 检测指标
　　1.2.4.1 抑瘤率 处死小鼠后剥瘤称瘤质量，计算抑瘤率. 肿瘤抑制率（％）=对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量/对照组平均瘤质量×100%.
　　1.2.4.2 切片检查 将瘤体浸泡于40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，制片，HE染色，光镜观察拍照.
　　1.2.4.3 瘤细胞周期检查 无菌取瘤组织， 切除坏死部分， 匀浆， 以PBS稀释成4×109个/L， 750 mL/L冷乙醇4℃固定. PI 避光染色30 min， 流式细胞仪上分析细胞周期. 每个数值为1×104个细胞的测定值.
　　1.2.4.4 淋巴细胞转化实验 MTT法. 无菌取脾，制备脾细胞悬液，台盼蓝染色观察活细胞数＞95％，调细胞数至6×109/L，加入96孔板，每孔100 μL， 各设6个复孔，放于37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养68 h，加MTT液20 μL，培养4 h， 离心1000 r/min，10 min弃上清，加DMSO液150 μL， 用微型振荡器振荡10 min，使甲赞颗粒溶解， 酶联免疫检测仪（570 nm）测定各孔A值.
　　1.2.4.5 T细胞亚群的检测 取4×109个/L的小鼠脾细胞悬液，PBS洗涤， 待测管中加入0.5 mL的细胞悬液，分别加入CD3FITC， CD4PE， CD8PE抗体，振荡混匀，室温避光放置30 min，PBS清洗，同上离心2次， 计数1×104个细胞， 上机检测细胞CD3， CD4， CD8阳性百分率，计算CD4+/CD8+比值.
　　统计学处理: 数据采用SPSS 11.0软件进行方差分析及Dunnnettt检验. 结果以x±s表示.
　　2 结果
　　2.1 双歧杆菌及顺铂对黑色素瘤生长的影响 采用双歧杆菌及顺铂治疗后，黑色素瘤的生长受到抑制，细菌高、低剂量组瘤质量分别为(0.992±0.121) g和(1.012±0.105) g，顺铂组瘤质量为(0.877±0.091) g，与对照组（2.200±0.105） g比较差异显著（P&<0.01）；但不同浓度双歧杆菌其瘤质量基本不变（P&>0.05），二者联合应用的抑制作用最强，瘤质量为(0.562±0.068) g，抑瘤率达74.45％.
　　2.2 黑色素瘤细胞的形态学变化 HE染色结果显示：肿瘤对照组B16细胞核质比例大，核呈圆形或卵圆形，核仁数目多，核分裂多见，紧密排列且有交错层叠现象;经顺铂作用后肿瘤组织呈片状坏死，部分细胞核质比例缩小，但肿瘤细胞排列紊乱；经不同浓度的双歧杆菌作用后，肿瘤组织除片状坏死外，肿瘤细胞排列有序，核质比例缩小，二者联合作用后肿瘤组织坏死现象增加（图1）.
　　A: 顺铂; B: 顺铂＋细菌; C: 细菌高剂量; D: 细菌低剂量.
　　图1 顺铂和双歧杆菌作用后肿瘤组织的改变 ×400
　　2.3 双歧杆菌及顺铂对瘤细胞周期的影响 与肿瘤对照组比较，应用不同浓度双歧杆菌后，瘤细胞主要阻滞于G1期，凋亡率无明显变化，应用顺铂后瘤细胞生长阻滞于S期，二者联合应用后，瘤细胞主要阻滞于S期，凋亡　　率明显上升.表1 双歧杆菌、顺铂及二者联合对瘤细胞周期的影响bP&<0.01 vs对照.
　　2.4 双歧杆菌及顺铂对荷瘤小鼠淋巴细胞增殖的影响 小鼠接种B16细胞后，其淋巴细胞活性略有增加，与正常组比较无统计学差异，说明B16细胞抗原性较弱；应用顺铂后，小鼠淋巴细胞活性减弱，增殖处于抑制状态，与正常组比较差异有统计学意义（P&<0.01）；应用不同剂量双歧杆菌后，小鼠淋巴细胞活性增强，与正常组比较差异有统计学意义（P&<0.01），但不同剂量之间差别无统计学意义；二者联合应用提高了小鼠淋巴细胞活性，与顺铂组比较差异有统计学意义（P&<0.01），与正常组比较，小鼠淋巴细胞活性减弱（P&<0.01）.

转贴于 图2 双歧杆菌、顺铂及二者联合对荷瘤小鼠淋巴细胞的作用
　　2.5 双歧杆菌及顺铂对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响 荷瘤小鼠T细胞亚群中不同细胞及其比例出现异常， 与正常组比较，肿瘤对照组CD4+， CD8+及其CD4+/CD8+细胞比值均属正常，CD4+， CD8+比例稍增加（P&>0.05），说明接种B16细胞后，荷瘤小鼠具有一定的免疫能力；经顺铂治疗后，表现为CD8+细胞比例下降（P&<0.01），说明其抗肿瘤免疫功能下降；而顺铂和双歧杆菌联合治疗后，CD4+比例稍下降，CD8+比例上升（与顺铂组比较P&<0.01），CD4+/CD8+比值正常，说明细胞免疫功能有所恢复；经不同剂量细菌作用后，CD4+比例较正常组增加（P&<0.01），说明其细胞免疫功能增强（表2）.表2 双歧杆菌、顺铂及二者联合对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的作用
　　3 讨论
　　恶性黑色素瘤的自行消退说明与机体的免疫功能有关. 近几年试用疫苗、干扰素、白细胞介素2和抗原肽激活的树突细胞等生物反应调节剂虽取得一定效果，但有些疗效不十分理想或有一定毒副作用［4-7］. 顺铂是常用的抗肿瘤制剂，其抑瘤杀瘤作用随其浓度的增加而加强，但由于其较大的毒副作用而限制了其临床应用；双歧杆菌是人体肠道的正常菌群成员之一， 近年来，国内外已注意到该菌作为生物反应调节剂在治疗肿瘤方面取得的成绩［8-10］.本作者研究了双歧杆菌、顺铂及二者联合的抑瘤作用，观察了瘤组织病理及细胞周期变化，检测了小鼠淋巴细胞增殖及T细胞亚群变化. 结果表明：皮下注射1×1010 cfu/L的双歧杆菌其抑瘤率可达54％，增加细菌浓度其抑瘤率基本不变；与顺铂联合应用后，其抑瘤率较单用顺铂明显增加，且小鼠的精神状态较单用顺铂好，说明双歧杆菌增强了顺铂的抑瘤作用，且减轻了顺铂的毒副作用；组织切片结果显示：经顺铂作用后肿瘤组织呈片状坏死，部分细胞核质比例缩小，但肿瘤细胞排列紊乱；经不同浓度的双歧杆菌作用后，肿瘤组织除片状坏死外，肿瘤细胞排列有序，核质比例缩小，二者联合作用后肿瘤组织坏死现象增加，说明双歧杆菌加强了顺铂的抑瘤杀瘤作用；流式细胞仪检测结果显示：双歧杆菌作用后瘤细胞生长阻滞于G1期，顺铂作用后瘤细胞生长阻滞于S期，说明DNA合成受到抑制，从而导致细胞分裂增殖减慢；通过测定小鼠淋巴细胞活性及T细胞亚群变化，结果显示：不同浓度双歧杆菌作用于小鼠后，CD4+及CD4+/CD8+比值较正常组增加，说明其细胞免疫功能增强，但二者之间无明显差异；顺铂作用后CD8+细胞明显减少，而CD8+细胞在杀伤肿瘤细胞中发挥主要作用，致使顺铂的抑瘤作用减弱；与淋巴细胞活性测定相符合；双歧杆菌和顺铂联合作用后，CD8+细胞明显上升，CD4+/CD8+比值正常，说明细胞免疫功能有所恢复；因此更好的解释了二者联合作用后其抑瘤率增加的原因.

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