关于中药蓝玉簪颗粒对慢性哮喘小鼠气道重建的影响及机制

【摘要】 目的：观察中药蓝玉簪颗粒对慢性哮喘小鼠气道重建的抑制作用并探讨其机制. 方法：将32只雌性BABL/c小鼠随机分成正常对照组（A组），慢性哮喘模型组（B组），蓝玉簪颗粒组（C组，1.0 g生药/3.0 kg体质量）和地塞米松干预组（D组，2.0 mg/kg），以卵白蛋白（OVA）腹腔注射致敏并长期雾化吸入制备小鼠慢性哮喘模型. 苏木素伊红（HE）染色观察小鼠肺组织一般病理学改变；阿尔辛蓝过碘酸希夫氏(ABPAS)染色观察气道上皮杯状细胞增生、黏液分泌情况；天狼猩红（SR）染色观察气道壁胶原沉积并检测肺组织羟脯氨酸（HYP）含量以评价气道上皮下纤维化，采用免疫组化半定量法测定气道壁转化生长因子β1 (TGFβ1）含量. 计算机图像分析软件测定气道外、内径比值（Po/Pi），气道壁厚度和面积（Awt，Aaw）以及TGFβ1免疫组化阳性染色面积与气道基底膜周径（Pbm）比值（如Awt/Pbm，TGFβ1/Pbm）等. 结果：B组小鼠气管及血管周围大量炎性细胞浸润，气道黏膜上皮增生，气道黏液高分泌及气道上皮下胶原沉积增多，气道壁TGFβ1表达增强；Po/Pi，Awt/Pbm，Aaw/Pbm以及TGFβ1/Pbm，肺组织HYP含量等所有指标均显著增高. C组与B组之间比较差异均有统计学意义（P&<0.01）；C组与A，D组比较差异具有统计学意义（P&<0.05）. TGFβ1的表达与肺组织HYP含量呈显著正相关（rs=0.669，P&<0.01）. 结论：中药蓝玉簪颗粒可以抑制慢性哮喘小鼠气道炎症及气道重建，其机制可能与抑制TGFβ1表达有关.
【关键词】 慢性哮喘 气道重建 动物模型 小鼠 蓝玉簪龙胆 转化生长因子β1
　　 0 引言
　　支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，常伴随气道高反应性和气道重建. 气道重建在疾病的早期即可发生，随病程进展而进行性加重，已被视为哮喘治疗的一个重要靶点［1］. 中药蓝玉簪颗粒(曾用名肺宁)主要成分为藏药蓝玉簪龙胆（G.veitchiorum Hemsl）和三七总甙（panax notoginside，PNS）等. 卫张蕊等［2］ 的研究发现蓝玉簪颗粒具有很强的抗炎和抗纤维化效应，能抑制成纤维细胞合成胶原纤维，可有效干预大鼠肺纤维化模型. 本实验建立慢性哮喘小鼠模型，观察中药蓝玉簪颗粒对气道壁胶原沉积，TGFβ1表达和气道壁厚度的影响，探讨其对气道重塑可能的作用机制.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 6～8周龄健康雌性清洁级BABL/c小鼠32只，平均体质量(18±2) g （第四军医大学实验动物中心提供）；卵白蛋白（ovalbumin，OVA）（美国Sigma公司）；兔抗小鼠TGFβ1多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；SP试剂盒（北京中杉金桥公司）；羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）碱水解法检测试剂盒（南京建成生物有限公司）；UV2000型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；402型超声雾化器 (上海鱼跃医疗仪器设备有限公司)；中药蓝玉簪颗粒（第四军医大学药理学教研室研制）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 动物模型制备与实验分组 将小鼠置于相对清洁恒温环境，给予标准饲料，自由取水并随机分为正常对照组（A组），慢性哮喘组（B组），蓝玉簪颗粒组（C组）和地塞米松干预组（D组）4组，每组8 只. 参照文献［3］的方法制备动物模型. 将OVA 100 μg加2.6 mg氢氧化铝溶于0.2 mL PBS溶液中制成悬液，于第1，7，14日给予B，C，D组小鼠腹腔注射，第15日开始将小鼠置于30 cm×20 cm×15 cm透明密闭容器中，以30 g/L OVA生理盐水溶液最大雾量超声雾化吸入，每日1次，每次30 min，连续6 wk. 雾化吸入前30 min，C组按1.0 g生药/3.0 kg体质量剂量灌胃给药；D组按2.0 mg/kg体质量剂量腹腔注射地塞米松溶液. A组以生理盐水代替OVA致敏和雾化激发. 4组小鼠在末次激发后24 h内摘除眼球放血处死，迅速留取右侧肺组织置于-70℃保存待测HYP，左肺内缓慢灌注40 g/L中性缓冲甲醛溶液，直至肺脏充盈后结扎，浸入40 g/L 中性缓冲甲醛溶液中室温下固定24 h，沿左肺门斜形平行取材，常规石蜡切片.
　　1.2.2 肺组织病理学观察及气道重建形态学测定 各组小鼠肺组织石蜡切片分别行苏木素伊红（HE）染色观察动物肺组织一般病理学改变，天狼猩红（SR）染色观察气道上皮下胶原沉积及阿尔辛蓝过碘酸希夫氏(ABPAS)染色观察气道上皮杯状细胞增生、黏液分泌情况. OLYMPUSBX51显微图像采集系统200倍下选取各组小鼠HE染色完整同级细支气管横截面50个（管腔长径/短径＜2），ImageProPlus 6.0（美国Media Cybernetics公司）医学图像分析软件进行计算机图像分析，测定气道外/内径（Po/Pi），气道壁面积（Aaw），气道壁厚度（Awt，以气道横断面12，3，6，9 点位置厚度均值表示）和气道基底膜周径（Pbm），以Po/Pi，Aaw/Pbm，Awt/Pbm作为评价气道重建形态学半定量指标.
　　1.2.3 HYP含量测定 采取组织碱水解法检测肺组织HYP含量，操作严格按照说明书进行，计算肺组织HYP含量（μg/g）.
　　1.2.4 免疫组化检测TGFβ1的表达 检测步骤按试剂盒说明书进行，兔抗小鼠TGFβ1多克隆抗体稀释度为（1∶100），DAB显色，苏木素轻度复染核，光镜下观察. 以细支气管壁TGFβ1阳性表达面积与Pbm的比值作为检测TGFβ1表达的半定量指标.
　　统计学处理：采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，正态分布数据以x±sD表示，行单因素方差分析和组间多重比较；偏态分布数据则以M±QR表示，行KruskalWallis H法秩和检验，组间多重比较采用Nemenyi法，相关分析用Spearman法，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 肺组织病理学变化 HE染色见A组小鼠支气管和肺泡结构正常；B组小鼠气道上皮坏死脱落，气道平滑肌层和网状基底膜层增厚，黏膜下及管壁周围有大量炎细胞浸润，气道壁增厚；C组表现较B组明显减轻，但重于D组(图1). SR染色见B组小鼠气道壁、血管壁及其周围有大量鲜红色胶原沉积，网状交错分布，气道上皮下纤维化明显增强；胶原沉积C组明显轻于B组；而A组胶原沉积最不明显(图2). ABPAS染色见B组小鼠气道黏液分泌旺盛，细支气管腔内有黏液栓形成，杯状细胞增生肥大，呈簇状聚集分布，胞质满含深紫红色及深蓝色颗粒；C组小鼠气道管腔黏液分泌较B组显著减少(图3).
　　2.2 气道重建形态学测定 图像分析结果显示B组小鼠Aaw/Pbm，Po/Pi及Awt/Pbm值均较A组明显增加（P&<0.01），C组则介于B组和D组之间，较B组均明显降低，差异具有统计学意义（P&<0.01，表1）. 2.3 肺组织HYP含量变化 各组小鼠肺组织HYP含量（x±sD，μg／g）比较发现，B组（798.09±272.99）较A组（236.79±76.15）及D组（269.29±87.13）均显著增高（P&<0.01），C组（415.86±94.82）较B组则明显降低，差异具有统计学意义（P&<0.01).表1 各组小鼠气道形态学参数比较（n=8，M±QR）aP&<0.05， bP&<0.01 vs蓝玉簪颗粒组.
　　2.4 TGFβ1免疫组化检测 检测结果显示，B组小鼠TGFβ1蛋白表达最强，呈棕黄色颗粒连续分布，以支气管黏膜上皮细胞表达最明显；A组表达不明显；D组小鼠呈微弱断续表达；C组TGFβ1表达水平明显低于B组，但是强于D组(图4). 图像分析结果显示A组TGFβ1/Pbm (μm2/μm，M±QR)为（0.86±1.35），B组(6.08±5.28)较之显著升高（P&<0.01)，D组(1.08±0.16)升高不显著（P&>0.05)，C组(1.92±2.54)则介于B组和D组之间，较B组明显降低，差异具有统计学意义（P&<0.01).
　　2.5 相关性分析 Spearman秩相关分析显示， 肺组织HYP含量与TGFβ1/Pbm值呈显著正相关（rs=0.669，P&<0.01）.
　　3 讨论
　　中药蓝玉簪颗粒以藏药蓝玉簪龙胆为君药独味成方，佐以 PNS 协同抗炎抗纤维化，可以提高 SOD 的活性，减少炎症细胞的渗出，抑制胶原沉积，从而抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，作用效果与强的松接近［2］.
　　慢性哮喘气道重建时气道形态学上表现为气道壁的增厚，气道壁横截面积增加，气道内径缩小；组织学上气道各层均可发生改变［4］. 本实验中OVA诱导的慢性哮喘小鼠表现出了典型的慢性哮喘气道重建特征. 我们在实验中观测到蓝玉簪颗粒可以显著减轻慢性哮喘小鼠气道炎症反应，抑制气道黏液高分泌，降低肺组织胶原含量，阻止气道上皮下纤维化，降低Po/Pi，Aaw/Pbm和Awt/Pbm等气道重建相关的半定量参数水平，对慢性哮喘气道重建表现出了显著的抑制作用. 但蓝玉簪颗粒组对哮喘的干预作用略弱于地塞米松干预组.
　　转化生长因子TGFβ可以诱导细胞分化、凋亡、存活和增殖等多种反应，目前的研究认为TGFβ参与了哮喘气道重建各个组成过程［4］，抗TGFβ Ab治疗后可以阻止慢性哮喘小鼠气道重建的进展［3］. 很多用于哮喘治疗的药物都与抑制TGFβ的表达及信号转导密切相关. 最常用的糖皮质激素抑制气道重建的作用也与其调节TGFβ1的表达、抑制TGFβ1信号通路有关［5］. 本研究发现蓝玉簪颗粒组TGFβ1表达明显减弱，并且肺组织HYP含量与TGFβ1/ Pbm值呈显著正相关，提示抑制TGFβ1的表达可能是蓝玉簪颗粒治疗慢性哮喘的作用机制之一.
　　综上，中药蓝玉簪颗粒可以抑制慢性哮喘小鼠气道炎症、黏液高分泌、胶原沉积和气道重构，可能的机制之一是抑制肺组织TGFβ1 的表达. 但其总的药效弱于地塞米松，可能与给药剂量较小有关，其进一步的机制仍有待深入探讨.

参考文献

［1］ Mimi LK， John WW， Alastair GS， et al. Airway remodelling in asthma: Current understanding and implications for future therapies［J］. Pharmacol Therapeutics， 2006，112:474-488.

［2］ 卫张蕊，田 琼，陈健康，等.中药肺宁对实验性肺纤维化的保护作用［J］.第四军医大学学报，2005，26(7):625-627.

［3 ］ Sarah JM，Georgina X，Clare ML，et al. Manipulation of allergeninduced airway remodeling by treatment with antiTGFβ antibody: Effect on the Smad signaling pathway［J］. J Immunol， 2005，174:5774-5780.

［4］ ToluwaloPe M，Richard FM，Devendra KA，et al.The regulatory role of TGFb in airway remodeling in asthma［J］. Immunol Cell Biol， 2007， 27:1-9.

［5］ Lee SY， Kim JS， Lee JM， et al. Inhaled corticosteroid prevents the thickening of airway smooth muscle in murine model of chronic asthma［J/OL］. Pulm Pharmacol Ther， ［20061020］.