多西他赛对乳腺癌细胞中TP酶的调节及其与化疗敏感性的分析

【摘要】 目的：探讨多西他赛对乳腺癌细胞中胸苷磷酸化酶（TP酶）的调节作用及其与化疗敏感性的关系. 方法：应用多西他赛诱导乳腺癌细胞中的TP酶，酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤组织中TP酶蛋白水平，采用MTT法检测药物敏感性变化. 结果：乳腺癌细胞株MCF7中TP酶含量为(30.1±1.4) μg/g，乳腺癌耐药株MCF/ADR的TP酶含量为(18.8±0.4) μg/g. 多西他赛能上调MCF7和MCF/ADR中TP酶表达，且具有时间、剂量双重依赖性. 耐药株中TP酶上调最高达(30.0±1.2) μg/L，未能达到非耐药细胞株水平. MCF7细胞中TP酶上调1.35倍，对氟铁龙的敏感性提高了2.06倍，有统计学意义. 结论：多西他赛能上调乳腺癌细胞TP酶，呈剂量时间依赖性.
【关键词】 胸苷磷酸化酶 5氟尿嘧啶 5′脱氧5氟尿苷 卡培他滨 多西他赛
　　0引言
　　胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)在恶性肿瘤中的含量明显高于正常组织［1］. 近年来发现许多细胞因子及临床放化疗都会影响TP的表达，而TP的表达与肿瘤细胞对于氟尿嘧啶类药物的敏感性密切相关，因此其相关临床药物(包括TP靶向药物和诱导药物)的研究受到关注，但在乳腺癌中的研究较少. 为此，我们探讨了多西他赛对乳腺癌细胞中TP酶的调节作用及其与化疗敏感性的关系.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人乳腺癌细胞株MCF7， MCF7/ADR由天津肿瘤医院中心实验室保存. RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司，MTT和DMSO为Sigma公司产品. 氟铁龙由上海罗氏制药有限公司生产；5氟尿嘧啶由天津金耀氨基酸有限公司生产；多西他赛由江苏恒瑞医药股份有限公司生产. TP酶检测试剂盒购自罗氏诊断公司. BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所.
　　1.2方法
　　将长满培养瓶对数生长期细胞用无菌PBS洗涤后加入2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，800 r/min离心8 min，加入一定量的培养液，调整细胞密度为4×109/L. 取细胞培养瓶，每瓶加入细胞悬液1 mL，再加入培养液4 mL. 37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培养箱继续培养24 h. 弃去原培养液，加入含多西他赛的新鲜培养液，使培养瓶中多西他赛的浓度分别为5， 20和50 μg/L，继续培养48 h，消化、收集、冻存细胞. 另向培养细胞中加入含20 μg/L多西他赛的新鲜培养液，37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培养箱继续培养24~96 h. 消化、收集、冻存细胞.
　　1.2.1检测肿瘤细胞TP酶水平取出-80℃冰箱中冻存的细胞，反复冻溶5次使细胞充分裂解. Eppendorff离心5 min后（13 000 r/min），收集上清150 μL. 按照说明书利用BCA法检测上清液蛋白浓度，ELISA检测肿瘤细胞中TP酶水平. 应用SPSS统计分析软件，绘制标准曲线，再根据测得的A值计算出TP酶浓度. 肿瘤细胞中的TP酶含量（μg/g）=样品TP酶浓度（μg/L）/上清液蛋白质的浓度（g/L）.
　　1.2.2MTT法药物敏感试验将对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔加入细胞悬液200 μL（1×104个），置37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养24 h. 弃去原培养液，分别加入含100， 10， 1， 0.1， 0.01 μg/L 5FU， 氟铁龙的新鲜培养液200 μL（每孔设3个复孔），继续培养48~96 h. 每孔加MTT 20 μL，培养4 h后，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振动10 min，用酶标仪测定每孔A值（测定波长570 nm）. 计算化疗药物的抑制率=（1-实验孔A570/对照孔A570）×100%. 将对数生长期细胞用含有20 μg/L多西他赛的培养液培养细胞24， 48， 72， 96 h后按照MTT法继续检测5FU和氟铁龙的敏感性. 进行相关回归分析，求出化疗药物的IC50.
　　统计学处理：应用SPSS统计分析软件，计量资料用x±s表示，不同组间比较采用方差分析及两两比较，组间方差不齐时采用非参数检验.
　　2结果
　　2.1乳腺癌中TP酶蛋白表达乳腺癌MCF7细胞株TP酶蛋白为(30.1±1.4) μg/g，耐药株MCF7/ADR的TP酶蛋白为(18.8±0.4) μg/g，明显低于非耐药株， 有统计学差异，P&<0.01. 应用多西他赛处理48 h后的MCF7细胞中的TP酶随着剂量浓度的增加有升高趋势，有一定的统计学意义. MCF/ADR细胞经多西他赛处理后，TP酶蛋白表达水平有所升高，但上升幅度不大，也表现出剂量依赖性， 未达到非耐药的MCF7细胞株的TP酶蛋白表达水平（表1）.表1多西他赛对乳腺癌细胞中TP酶的调节(略)
　　应用20 μg/L多西他赛后MCF7中的TP酶蛋白表达随着作用时间的延长而增高，72 h达高峰（40.6±1.3） μg/g，此后下降. MCFADR在应用20 μg/L多西他赛48 h开始升高，72 h达高峰，96 h已明显下降（表2）.表220 μg/L多西他赛对乳腺癌细胞中TP酶的影响(略)
　　2.2多西他赛对乳腺癌细胞化疗敏感性的影响应用多西他赛20 μg/L对MCF7细胞无明显细胞毒作用，也无促进细胞生长作用. 应用多西他赛20 μg/L作用24， 48， 72 h后能明显提高MCF7细胞对氟铁龙的敏感性（P&<0.05）. IC50在TNF作用72 h最低（表3）.表3多西他赛20 μg/L作用时间与MCF7细胞对氟尿嘧啶类药物敏感性的关系(略)
　　3讨论
　　TP是近年来发现的嘧啶核苷代谢过程中的一个关键酶，是5FΜ前体药物（卡培他滨、脱氧氟尿苷）转化为氟尿嘧啶的最后一个限速酶. TP酶与肿瘤的化疗关系密切，它能增强患者对以5FU为主的化疗敏感性，提高化疗效果，改善肿瘤患者的预后［2］；白介素1（IL1）、肿瘤坏死因子（TNFα）、干扰素γ（INFγ）等多种因子能够上调肿瘤细胞内的TP酶表达［3-5］. 紫杉醇、多西紫杉醇、丝裂霉素等化疗药物能提高肿瘤组织中TP酶水平，而且TP酶的上调和TNFα呈直线正相关［6］.

　　我们的研究发现氟铁龙对MCF7细胞的IC50为(12.85±0.46) mg/L，经小剂量多西他赛20 μg/L作用后的MCF7细胞其IC50明显降低，在作用72 h最低［(6.24±0.46) mg/L］. 推测与小剂量多西他赛作用后MCF7细胞中TP酶升高到最高有关. 即TP酶活性提高1.35倍，MCF7对氟铁龙的敏感性提高了2.06倍. 早有研究证实TP酶活性提高90倍，氟铁龙的敏感性提高165倍［7］. 本实验结果与上面文献报道尚有明显差距. 动物模型实验研究表明［6］，应用多西紫杉醇后TP酶的上调和TNFα呈直线正相关，Eda等［5］研究也发现，TP酶上调之前TNF首先上调，由此推论，多西紫杉醇可能通过影响肿瘤组织中基质细胞上调TNFα水平，间接上调TP酶蛋白. Fukushima等［2］研究则发现，紫杉醇给移植物鼠模型注射后（60 mg/kg）后原本低TP酶表达的肿瘤细胞（KB和KM20C）中的TP酶水平上调了3倍和7倍，对于原本高表达的肿瘤细胞（MX1和H31）无上调作用. 本实验由于是体外实验，缺乏肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞作用，结论与Fukushima等［2］实验结果不完全相同.

【

参考文献

】
　　［1］Matsushita S，Nitanda T，Furukawa T，et al. The effect of a thymidinephosphorylase inhibition angiogenesis and apoptosis in tumors［J］. Cancer Res， 1999， 59(9): 1911-1916.

　　［2］Fukushima M， Okabe H， Takechi T， et al. Induction of thymidine phosphorylase by interferon and taxanes occurs only in human cancers cells with low thymidine phosphorylase activity［J］. Cancer Lett， 2002，187（12）: 103-110.

　　［3］安永恒，丁爱萍，梁军. 肿瘤合理用药［M］. 北京:人民卫生出版社，2004:524-575.

　　［4］Ishikawa T， Mtoh M， Sawada N， et al. Tumor selective delivery of 5fluorouracil by capecitabine， a new oral fluoropyrimidine carbamate， in human cancer xenografts［J］. Biochem Pharmacol， 1998， 55(7): 1091-1097.

　　［5］Eda H， Fujimoto K， Watanabe S， et al. Cytokines induce thymidine phosphorylase expression in tumor cells and make them more susceptible to 5′deoxy5fluorouridine［J］. Cancer chemother Phamacol， 1993，32(5): 333-338.

　　［6］Goto H，Kohno K，Sone S，et al. Interferon gammadependent induction of thymidine phosphorylase/plateletderived endothelial cell growth factor through gammaactivated sequencelike element in human macrophages［J］. Cancer Res， 2001， 61:469-473.

　　［7］Patterson AV， Zhang H， Moghaddam A， et al. Increased sensitivity to the prodrug 5′deoxy5fluorouridine and modulation of 5fluoro2′deoxyuridine sensitivity in MCF7 cells transfected with thymidine phosphorylase［J］. Br J Cancer， 1995， 72(3): 669-675.

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