第 1 章 绪论
1.1 水体资源破坏现状
伴随着中国经济体系的迅速扩张以及人民生活水平的稳健上升，过量的使用各种含氮化肥、农药[1]，相关工厂排放污水处理方式的落后，排放污水处理效果达不到预期标准等原因使得大量的含氮废物被违规排放到自然水体之中。不仅导致水体富营养化同时水体污染问题也变得日益严重[2, 3]，已经成为制约国家经济发展的主要因素，目前如何控制水质污染受到了广泛的关注。
根据中国生态环境部最新公布的《中国生态环境状态公报》，可以得知，在 2018年中，在国家监测的 1935 个地表水水质断面中，其中Ⅰ～Ⅲ类的占比 71.0%，较去年小幅度的提升了 3.1%，劣Ⅴ类占比 6.7%，较去年降低了 1.6%。
由下图 1-1、1-2 可知，2018 年各个河流断面 1613 个水质监测断面中，其中Ⅰ~Ⅴ类的占比分别为 5.0%、43.0%、26.3%、14.4%、4.5%、6.9%。污染情况得到了一定的改善，但依旧还有很多河流存在轻度与中度污染。
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1.2 水体中氮素污染的危害
水体中超量的氮元素存在，会带来一系列环境问题[5]，其会直接影响水体的水质从而对微生物的生长以及生物的生存环境造成影响。这些危害一般体现在以下几个方面：
(1) 影响水体质量
水体中含氮污染物超量存在会使水体发生富营养化。当含氮污染物流入河流湖泊以后，可以为水中藻类和水生植物的生长提供丰富的营养物质，造成藻类和水生植物的迅速繁殖生长，导致水中溶解氧含量大幅度降低，水生生物无法在此类水体中生存，水生生物缺氧死亡，使得水体逐渐变黑发臭，引起水体黑臭现象[6]。当在近海水域发生水体富营养化情况时，则容易引发赤潮现象。
(2) 威胁生物健康
当人与动物摄入的水中氮素超标时，对人体与动物的健康都造成严重的危害[7]。硝酸盐是一种很容易溶解于水的氮素，当人体摄入含有此类物质的饮用水，一些硝酸盐氮会被转化生成为亚硝酸盐氮，进而升高血液中高铁血红蛋白的浓度，此类物质可以抑制血液的携氧性能，严重时甚至能导致个体死亡[8]。同时亚硝酸盐与蛋白结合会形成亚硝酸胺类物质，这种物质具有致癌致畸变的危害，直接损害人类的生命安全[9]。
(3) 增加水体处理的成本
若水体中含氮类污染物浓度过高，相应的处理厂就需要增加更多更负责的处理设置以保证处理出水的安全性。氮素污染对污水处理成本的提升体现在：1、在饮用水以及工业循环水的杀菌处理过程中，若氮类污染物的含量过高便需要投加更多的消毒剂，从而使得“致癌、致畸、致突变”类物质危害到人类的生命安全[10]；2、对一些金属管道会产生腐蚀性，降低耐用性；3、使得管道内能利用含氮污染物的微生物大量繁殖，生物膜的大量生成会堵塞管道以及各种用水设备；4、在微生物的作用下，含氮类污染物能够在不同的形式之间转换，使得水体发臭，产生异味[11]。
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第 2 章 耐低温好氧反硝化细菌的筛选与鉴定
2.1 本章概述
具有好氧反硝化能力的微生物有着广泛的来源与分布，现已经有许多不同菌属的好氧反硝化细菌被专家学者们分离出来。获得在低温状态下具有良好脱氮效果的好氧反硝化细菌是解决冬季污水处理厂出水水质难以达标的突破口之一，本次实验于冬季采集石家庄某市政污水处理厂 A2O 处理工艺中不同工艺段的活性污泥，先通过菌株的富集、然后进行富集菌株的分离、之后进行纯化、对于具有低温好氧反硝化功能进行菌株的初筛与复筛。对得到的菌株进行形态学分析、生理生化鉴定、16Sr RNA 鉴定。以期为未来冬季污水厂处理含氮废水提供高效耐低温好氧反硝化细菌的菌种。
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2.2 实验材料
2.2.1 菌株样品来源
本次实验样品采集与冬季石家庄某市政污水处理厂 A2O 处理工艺中不同工艺段的活性污泥，用以筛选低温好氧反硝化微生物。采样时间为 2018 年 11 月 15 日，采样时工艺段水温约为 17℃，采样容器为 121℃灭菌干燥后的玻璃器皿，各工艺段采样量为 1 L，样品采集后即刻置入携带的低温保温箱之中，立即送往实验室处理样品。
2.2.2 实验仪器及药品
实验研究中主要使用的仪器如下表 2-1 所示：
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3.1 实验材料······························23
3.1.1 菌株样品···························23
3.1.2 实验仪器及药品···················23
第 4 章 菌株 41 好氧反硝化脱氮条件的优化·································35
4.1 实验材料···································35
4.1.1 菌株样品························35
4.1.2 实验仪器及药品······························35
第 4 章 菌株 41 好氧反硝化脱氮条件的优化
4.1 实验方法
在前面的章节中，研究验证了单因子环境因素对 Pseudomonas sp.41 好氧反硝化能力的影响，为了探究多因子环境因素共同作用对于好氧反硝化的影响，在本次实验中选用响应曲面分析方法。
为了确定温度、DO、pH 和 C/N 对菌株 41 好氧反硝化的影响，根据以上因素确定实验的设计因素与水平，利用响应面曲面分析方法中的 Box-Behnken 设计方法对实验进行四因素三水平的响应面实验设计。表 4-1 说明了实验的设计变量因素（温度，振荡速度，初始 pH 和 C/N）以及其编码水平（﹣1，0，1），表 4-2 表示了菌株 41的实验设计思路，设计了在实验中需要控制的实验因素条件。
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结论
本次实验以石家庄某市政污水处理厂 A2O 处理工艺段中的活性污泥为菌种来源，顺利分离富集出 40 株具有好氧反硝化功能的菌株，其中 96%的菌株皆为假单胞菌属细菌。
在低温培养条件下筛选出一株生长特性优良的好氧反硝化细菌，经过形态鉴定、生理生化鉴定与分子生物学鉴定，判断菌株属于 Pseudomonas sp.，将得到菌株 41 的16S r RNA 基因序列上传到 Genbank 数据库中，得到其登录号为 MN197797，将其命名为 Pseudomonas sp.41。并从 PCR 扩增产物所进行的电泳凝胶产物中观察到了876~884 bp 长度的反硝化功能基因 napA，进一步验证了菌株 41 的好氧反硝化潜能。单因素环境因子实验表明，碳源、C/N、温度、DO、pH 对菌株 41 的好氧反硝化强度影响较大。当柠檬酸钠作为碳源、pH 在 7~9 之间、温度 15~30℃、C/N 高于10，菌株均能在 48 h 内去除几乎所有的 NO3?-N，且最终无 NO2?-N 的积累，对水体中总氮的去除率在 90.73%以上。在一定范围内，随着 C/N、pH、温度的升高，反硝化的速率都有不同程度的上升。综合实验结果分析，菌株 41 的最适碳源为柠檬酸钠，最适宜 C/N 为 10~15，最佳反应 pH 为 9。
通过响应面分析方法确定了多因素共同作用对菌株 41 好氧反硝化能力的影响，得到菌株 41 最佳的复合脱氮条件为初始 pH 为 8.21，C/N 为 12.81，摇动速率 115.37rpm，温度为 28.57℃，此培养条件下，菌株的 36 h 好氧反硝化去除效率可以达到97.67%，并推断对影响菌株 41 好氧反硝化脱氮性能的四个环境因素进行由强到弱的重要性排序为初始 pH＞C/N＞温度＞摇动速度（DO）。
参考文献（略）