作者：李旭，周西华，蔡景理，叶乐驰，陈荣，郑晨果
【摘要】 目的 ：研究CO2气腹压力和持续时间对人结肠癌SW480细胞增殖的影响。方法：建立体外模拟CO2气腹环境，在全自动气腹机作用下，维持密闭真空压缩袋内不同压力(9、12、15 mmHg)，不同持续时间(1、2、4 h)作用于SW480细胞，作用后12 h，流式细胞仪观察细胞周期变化;作用后12、24、36、48、60和72 h，MTT法检测细胞增殖情况。结果：流式细胞仪检测细胞周期结果显示，CO2气腹压力对于人结肠癌G0/G1期细胞数值有显著影响(P &<0.01)，对于S期、G2/M期细胞周期无影响。而不同CO2气腹持续作用时间对于各细胞周期无影响(P &>0.05)， CO2气腹压力与作用时间对于各细胞周期不存在交互作用(P &>0.05); MTT法结果显示CO2气腹下各组人结肠癌SW480细胞在不同压力和持续时间作用后12～72 h检测的平均D(490)值均小于对照组。通过析因设计的方差分析，在CO2气腹作用后12、24、36、48、60和72 h，压力与作用时间对SW480细胞的增值无交互作用(P &>0.05)。压力在24、36 h对SW480细胞的增值有一过性抑制作用(P &<0.01)，在SW480细胞增殖初、后期都无影响(P &>0.05);不同作用时间对SW480细胞的增值无影响(P &>0.01)。结论：CO2气腹不同压力对结肠癌细胞的增殖有一过性抑制作用，CO2气腹72 h内不同作用时间对结肠癌细胞的增殖未见明显影响。
【关键词】 CO2气腹;结肠癌细胞;腹腔镜;增殖;细胞周期
Abstract: Objective: This study aimed to explore the influence of CO2 pneumoperitoneum administered with different pressures and exposure time multiplication of cultured human colonic cancer cells. Methods: SW480 was subjected to a simulated laparoscopic CO2 pneumoperitoneum environment at various CO2 pressures (9，12 and 15 mmHg) and exposure time(1，2 and 4 h). Cellscultured in a standard environment were used as the control. The cell cycle were examined by flow cytometry after they were moved to normal conditions for 12 h ;the cell proliferation ofSW480 cells was examined with MTT method after they were moved to normal conditions for 12，24，36，48，60 and 72 h，respectively. Results: The results of colonic cancer cell cycle measured with flow cytometry showed that CO2 pneumoperitoneum administered with different pressures hadsignificant affect on the the numerical values of G0/G1 phase(P &<0.01)，however no affect on the numerical values of S，G2/M phase. CO2 pneumoperitoneum administered with different xposuretime had no significant influence on the cell cycle(P &>0.05). There was no interaction betweenCO2 pneumoperitoneum pression and exposure time (P &>0.05). After exposed to different CO2pneumoperitoneum pressure and exposure time (12～72 h)，the average absorbance values(490)of human colonic cancer SW480 cells examined by MTT assay were decreased compared with the controlgroup. There was no interaction between CO2 pneumo-peritoneum pressure and exposure time(P &>0.05)for the proliferation viability of SW480. The CO2 pneumoperitoneum pressure had temporary effectfor the proliferation viability of SW480 at 24 h and 36 h (P &<0.01)， and no effect for the primaryand anaphase of cell proliferation of SW480(P &>0.05). The proliferation viability of SW480 exposedwithin different time was not statistically different (P &>0.01). Conclusion: CO2 pneumoperitoneumadministered with different pressures can temporarily inhibit the growth of human colonic cancercells;CO2 pneumoperitoneum administered with different exposure time does not promote the growthof human colonic cancer cells.
Key words: CO2 pneumoperitoneum;colonic cancer cells;laparoscopes;proliferation;cell cycle
多项RCT研究显示，腹腔镜结直肠癌手术与开腹手术具有相当的近、远期疗效，美国结 直肠癌外科医师协会已将其列为治疗结直肠癌的标准手术方式之一[1]。然而腹腔镜所需的气腹改变了腹腔内原有的压力以及高浓度CO2改变了结肠癌细胞原有的生存环境，是否会因此促进肿瘤的增殖，提高播散率与转移率临床上尚有争议[2]。本研究拟通过体外模拟CO2气腹环境，观察其对人结肠癌SW480细胞增殖的影响，探讨CO2气腹的压力、持续时间与结肠癌细胞增殖之间的关系。
1 材料和方法
1.1 主要试剂及仪器
人结肠癌SW480细胞株(中科院上海细胞库)，二甲基亚枫(DMSO)购于Sigma公司，小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI 1640购于美国hyclone公司，碘化丙啶染液(PI)购于杭州联科公司，胰蛋白酶购于美国Gibco公司，MTT试剂盒购于南京凯基公司，细胞培养板购于德国Greiner公司，全自动气腹机购自德国MGB公司，流式细胞仪购于美国BD公司，电子PH计购于瑞士Mettler公司，680酶标仪购于美国伯乐公司。
1.2 方法
1.2.1 人结肠癌SW480细胞的培养：选用人结肠癌SW480细胞，在含有10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养。置于37 ℃、5% CO2密闭细胞培养箱中，每2 d更换1次培养液。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 体外气腹模型的建立：见图1。选45 cm×70 cm大小的塑料真空压缩袋(环氧乙烷熏 蒸消毒)，袋内置一大小约25 cm×40 cm的平低塑料筐(消毒方法：紫外线照射半小时。作用：保持平衡，防止通气时压缩袋内培养板倾斜，培养液外流)，压缩袋气嘴口用橡皮塞封 闭，用直径约1 cm的玻璃管自橡皮塞中间插入，玻璃管另一端通过胶皮管连接全自动气腹机。培养板或培养瓶放入真空压缩袋内的平底塑料筐内，袋口折叠2～3次，用宽透明胶带密闭后，用抽气筒抽尽袋内空气，然后打开全自动气腹机，调整到所需压力后通入99.5%医用CO2气体。
1.2.3 分组：气腹组共9组：CO2气腹压力分别设定为9、12和15 mmHg，作用时间分别为1、2、4 h，处理后放置在与对照组相同的环境中继续培养(气腹组分别以压力-时间表示为9 mmHg-1h，9 mmHg-2 h，9 mmHg-4 h，12 mmHg-1 h，12 mmHg-2 h，12 mmHg-4 h，15 mmHg-1 h，15 mmHg-2h，15 mmHg-4 h共9组)。对照组：直接放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，培养时间同实验组。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期变化：将处于对数生长期的人SW480结肠癌细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×105/mL，分别取5 mL加入到50 mL的细胞培养瓶中(每个培养瓶含细胞约5.0×105 个)。CO2气腹环境中处理后放在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养12h。取出培养瓶，0.25%胰酶消化、置于离心机中，离心，弃上清，加入1 mL PBS重悬10 min，把细胞悬液加入到4 mL、-20 ℃的75%乙醇中，然后置于-20 ℃的冰箱中放置10 min，同上法再离心，弃去酒精，再加入5 mL PBS重悬10 min，再次离心，弃上清，最后加1 mL碘化丙啶染液(PI)重悬30 min后，置于流式细胞仪行细胞周期分析。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖活性 取单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0 ×104/mL，接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加入细胞悬液100μL(即每孔约含细胞1.0×103个)，置 于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁后按1.2.3方法分组处理，处理后置入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，并分别于第12、24、36、48、60和72 h各取6个复孔，每孔 加入50μL的MTT，继续培养4 h后，用2 mL注射器小心吸出培养液和MTT溶液，然后每孔再加入DMSO 150μL，振荡器微振荡10 min后，置于全自动酶标仪于490 nm处测定各孔吸光度值[D(490)]，取均值，绘制生长柱状图。
1.3 统计学处理方法
压力与时间两因素析因设计资料采用方差分析。
2 结果
2.1 CO2气腹压力与作用时间对人结肠癌SW480细胞周期的影响
为了解CO2气腹压力与作用时间是否存在交互作用，进行析因分析，结果见表1。CO2气腹压力对于人结肠癌G0/G1期细胞数值有显著影响(P &<0.01)，对于S期、G2/M期无影响，而CO2气腹持续作用时间对于各细胞周期无影响(P &>0.05)，CO2气腹压力与作用时间无交互作用(P &>0.05)。
2.2 CO2气腹压力与作用时间对人结肠癌SW480细胞增殖的影响
采用MTT试验分析气腹压力与作用时间对人结肠癌SW480细胞增殖的影响，发现CO2气腹组各组人结肠癌SW480细胞在不同压力和持续时间作用后12～72 h检测的平均D(490)值均小于对照组，说明CO2气腹不会促进结肠癌细胞的增殖。结果见图2。在CO2气腹作用后12、24、36、48、60和72 h，压力与作用时间无交互作用(P &>0.05)。压力在24、36 h对SW480细胞的增值有显著的一过性影响(P&<0.01)，在SW480细胞增殖初期、后期都无影响(P &>0.05);作用时间对SW480细胞的增值无影响(P &>0.01)。见表2。
3 讨论
本实验建立体外CO2气腹环境时，在参照郑民华等[3]气腹模型的基础上，创新性地利用了真空压缩袋和全自动气腹机的模式，成功建立了体外模拟CO2气腹环境。该方法简单易行，可操控性强，压缩袋可随气体压力变化而呈现不同的膨胀程度，更接近于人体腹壁的膨胀原理，能准确地控制实验所需的体外模拟CO2气腹压力和时间，能直接、准确地反映CO2气腹与结肠癌细胞增殖之间的关系。同时根据临床实践中，腹腔镜手术常用的CO2气腹压力和手术时间，建立并保持体外模拟CO2气腹的压力维持在9、12、15 mmHg三个压力梯度，观察不同持续作用时间(1、2、4 h)CO2气腹对SW480细胞体外增殖的影响。我们认为该方式更符合临床工作实际，从而能更科学地反映体外模拟CO2气腹环境对人结肠癌细胞生物学行为的影响。尽管多中心随机对照试验(COST研究)发现在远期疗效方面，腹腔镜结肠癌切除术也不亚于开腹手术[4]。然而，腹腔镜手术需要建立CO2气腹环境，持续CO2气腹环境是否会促进肿瘤细胞的增殖，增加播散和种植转移的危险，目前仍有争论。有学者报道CO2气腹会抑制肿瘤细胞的增殖和生长。Leng等[5]建立体外模拟CO2气腹环境，培养的卵巢癌HO8910细胞和SKOV3细胞会随着压力的升高、时间的延长，其凋亡的比例增加。Tan等[6]在对移行细胞癌(TCC)的研究中得出结论：CO2对于细胞有毒性作用，并且能够抑制细胞的黏附力和生长，高CO2压力(≥15 mmHg)能够非常有效地减少细胞的黏附和生长能力。Hao等[7]报道体外模拟CO2气腹环境在临床常用压力范围内(≤10 mmHg)，CO2对胃癌细胞株MKN-45增殖、凋亡无明显影响，而在15 mmHg压力下，CO2抑制株MKN-45细胞的增殖促进其凋亡。也有学者持相反观点，报道CO2气腹会促进肿瘤细胞的增殖和生长。Zhang等[8]研究卵巢癌细胞暴露在不同CO2压力(8～12 mmHg)1～3 h后发现卵巢癌细胞黏附和转移能力增加与CO2的压力和暴露时间有确切的关系。干晓琴等[9]报道CO2气腹不同压力均可促进人宫颈癌CaSki细胞的体外生长，且在一定的压力状态下表现出较强的促细胞生长效应。
本实验中采用MTT法发现CO2气腹组各组人结肠癌SW480细胞在不同压力和持续时间作用后12～72 h检测的平均D(490)值均小于对照组，说明CO2气腹不会促进结肠癌细胞的增殖，析因分析结果显示：CO2气腹压力在24、36 h对SW480细胞的增殖有显著的一过性影响 (P &<0.01)，压力对于细胞的增殖有一过性的抑制作用。众所周知细胞周期分为DNA合成前 期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)及有丝分裂期(M期)。G1期为下一步DNA复制及蛋白质合成作准备，在增殖旺盛的细胞群中，G1期细胞比率低，而在增殖慢的 细胞群中，G1期细胞比率会升高。细胞增殖抑制通常可归因于作用因素对细胞的杀伤作用及细胞周期阻滞作用。研究中我们通过流式细胞仪将处于各细胞周期的细胞分选，发现CO2气腹组人结肠癌细胞增殖速度较对照组低，且气腹组细胞的G1期比例较对照组有增加，但两者差异不显著。进一步析因分析结果显示，CO2气腹压力对于细胞周期的G0/G1期有显著影响(P &<0.01)，G1期细胞比率升高，阻滞于G0/G1期，抑制肿瘤细胞生长，细胞增殖减慢，CO2气腹压力对于细胞增殖有抑制作用，而作用持续时间对细胞增殖无影响。本研究提示CO2气腹不同压力对结肠癌细胞的增殖有抑制作用，且在一定的压力状态下表现出较强的抑制细胞生长效应;CO2气腹72 h内不同持续作用时间对结肠癌细胞的增殖未见明显影响。
参考文献
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