作者：施通，刘乐，施克俭，王权光，陈莺，王方岩，徐旭仲
【摘要】 目的?：探讨脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性可能的作用机制。方法：SD雄性大鼠72只，随机分成六组：A组(布比卡因致心脏停搏脂肪乳剂复苏组)、B组(布比卡因致心脏停搏K-H液灌注组)、C组(布比卡因致心脏停搏组)、D组(平衡灌注25 min组)、E组(含脂肪乳剂的K-H液灌注组)、F组(K-H液灌注组)，每组12只。记录灌注期间的心率-左心室发展压乘积(RPP)，测定停灌时各组心肌组织腺苷酸含量和布比卡因浓度。结果：A组复跳例数、早期复跳例数均显著多于B组(P?&<0.01)。A组复跳时间显著短于B组(P?&<0.05)。复跳后40 min内，A组的RPP均显著高于B组(P?&<0.01)。A组的EC值显著低于B组(P?&<0.05)。心肌组织中的布比卡因浓度从高到低依次为C组&>B组&>A组(P?&<0.01)。结论：脂肪乳剂降低心肌组织布比卡因浓度，是其逆转布比卡因心脏毒性的主要作用机制。
【关键词】 脂肪乳剂;布比卡因;心脏复苏;心脏停博，人工;大鼠
Abstract: ? Objective: To explore and discuss the possible mechanism of lipid emulsion to rescue the bupivacaine-induced cardiac arrest. Methods:?The hearts of male Sprague-Dawley rats were excised and retrogradely perfused in an nonrecirculating Langendorff preparation. They were randomly pided into six groups (twelve hearts per each group). In group A，B and C，after Krebs-Henseleit buffer?(KHB)?was perfused for 25 min，100μmol/L bupivacaine was perfused until 3 min after asystole. Then 2% lipid emulsion and 30μmol/L bupivacaine mixture was perfused in group A;30μmol/L bupivacaine was perfused in group B;perfusion was stoped at that time in group C. In group D，E and F，KHB was perfused for 25 min. Then 2% lipid emulsion was perfused for 40 min in group E?;KHB was perfused for 40 min in group F?;perfusion was stoped at that time in group D.?The time from the end of the perfusion with 100μmol/L bupivacaine to the heart resuscitation?(Tr)?were compared between group A and B.The cases of recovery (heart beating recovered after the end of the 100μmol/L bupivacaine perfusion) and the cases of early recovery (heart beating recovered within 3 min after the end of the 100μmol/L bupivacaine perfusion) were recorded. Rate-pressure product (RPP=heart rate×[left ventricular systolic pressure-left ventricular diastolic pressure]) during the course of resuscitation in group A and B were monitored. RPP during the course of perfusion in group E and F were monitored. At the end of each protocol，?myocardial tissues were taken from the apex of the left ventricle for measuring ATP，ADP，AMP，total adenine nucleotides (TAN) and energy charge (EC).?The concentrations of bupivacaine in myocardial tissues among group A， B， C were also measured. Results:?The recovery cases and the cases of early recovery in group A were more than those in group B (P?&<0.01). The time of recovery of heart beating in group A was significantly shorter than that in group B (P?&<0.05). RPP was significantly higher in group A during 40 min after recovery of heart beating than those in group B (P?&<0.01). Comparison of RPP revealed no significant differences between group E and F during perfusion (P?&>0.05). EC in group A was lower than that in group B (P?&<0.05). Comparison of ATP， ADP， AMP， TAN and EC revealed no significant differences between group C and D， so did group E and F (P?&>0.05). The group order of myocardial bupivacaine concentration was group C?&>?group B?&>?group A (P&<0.01).Conclusion: Resuscitation with lipid emulsion on bupivacaine-induced cardiac arrest results in more rapid recovery of heart beating and improves cardiac function during the course of recovery. Lipid emulsion decreases the concentration of bupivacaine in cardiac tissue，which maybe the main mechanism of lipid rescue.
Key words: ? fat emulsions;heart rescue;bupivacaine;heart arrest，induced;rats
布比卡因是临床麻醉中常用的长效局麻药，具有作用时间长、麻醉效能强、价格低廉等优点，但误入血管可导致严重的心脏毒性，复苏困难。近年来国内外有文献报道称脂肪乳剂治疗布比卡因心脏毒性有效的动物实验[1-6]，但对于其逆转局麻药心脏毒性的机制仍存在争议。本研究拟观察脂肪乳剂治疗布比卡因诱导的离体大鼠心脏停搏的复苏效应和对复苏后心脏功能的影响，并探讨脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性可能的作用机制。
1??材料和方法
1.1??实验动物和分组??Sprague-Dawley雄性大鼠72只，体重300～350 g，由温州医学院实验动物中心提供。随机分为六组，A组为布比卡因致心脏停搏脂肪乳剂复苏组，B组为布比卡因致心脏停搏K-H液灌注组(A组的对照组)，C组为布比卡因致心脏停搏组，D组为平衡灌注25 min组(C组的对照组)，E组为含脂肪乳剂的K-H液灌注组，F组为K-H液灌注组(E组的对照组)，每组12只。
1.2??Langendorff离体心脏灌注模型??大鼠称重后，以5%水合氯醛(7 mL/kg)腹腔内注射麻醉、肝素1?000 U/kg下腔静脉注射抗凝。迅速开胸取心，固定于Langendorff灌流装置(ML870B2，埃德仪器有限公司，澳大利亚)，以改良K-H液[7]经主动脉根部行逆行灌注。采用恒压恒温灌流，灌注压力120 mmHg，灌注液温度37 ℃。灌注液用95% O2+5% CO2预充30 min。在左心耳根部剪一小口，经左心房、房室瓣置入一乳胶球囊(连接压力传感器)，后者与Powerlab及Chart 5.5.6生物信号数据记录及分析系统(ML870，埃德仪器有限公司，澳大利亚)连接。往心室球囊内缓慢注射适量生理盐水，维持左心室舒张末期压力(LVEDP)4～10 mmHg。于主动脉根部和左心室前壁心外膜分别安置铜丝电极，连接心电导联，通过Powerlab实时监测心脏表面心电图。
1.3??实验处理??A组、B组、C组心脏在建立Langendorff离体心脏灌注模型平衡灌注25 min后，建立布比卡因心脏中毒模型，以含100μmol/L布比卡因(上海禾丰制药有限公司，批号080501)的K-H液灌入主动脉，心电图显示心脏电活动停止时记为心脏停搏，继续灌注含100μmol/L布比卡因的K-H液3?min，造模成功。之后A组改用含30μmol/L布比卡因及2%脂肪乳剂(无锡华瑞制药有限公司，批号070404)的K-H液灌注心脏，B组改用含30μmol/L布比卡因的K-H液灌注心脏。两组中能复跳的离体心脏于复跳后继续观察40?min后停灌，未复跳的心脏在造模后继续观察40?min后停灌。心脏复跳的标准：有规则心律，恢复后RPP值&>基础RPP的10%，且持续1?min以上。C组在布比卡因心脏中毒造模成功后立即停灌。D组、E组、F组心脏建立Langendorff离体心脏灌注模型平衡灌注25?min后，D组在平衡灌注25?min末停灌，E组改用含2%脂肪乳剂的K-H液继续灌注心脏40?min后停灌，F组继续以K-H液灌注心脏40?min后停灌。
1.4 指标测定
1.4.1??记录A组、B组开始输入布比卡因至心脏停搏所需时间(Ts)及造模成功至复跳所需时间(Tr)。记录A组、B组心脏复跳的例数及造模成功后3 min内复跳(早期恢复)的例数。
1.4.2??记录A组、B组心脏在平衡末(基础值，Tb)、心脏停搏时(T0)、复跳后1 min(T1)、5 min(T5)、10 min(T10)、15 min(T15)、20 min(T20)、25 min(T25)、30 min(T30)、35 min(T35)、40 min(T40)时的心率-左心室发展压乘积值(RPP)。左心室发展压=左心室收缩压力-左心室舒张末期压力。记录A组、B组心脏在复跳后40 min内RPP达到的最大值(RPPh)，并计算该值与Tb时RPP值的比值(RPPr，用百分比表示)。
1.4.3??记录E组、F组心脏在平衡末(基础值，Tb’)、继续灌注5 min(T5’)、10 min(T10’)、15 min(T15’)、20 min(T20’)、25 min(T25’)、30 min(T30’)、35 min(T35’)、40 min(T40’)时的RPP。
1.4.4??A组、B组中能复跳的心脏及C组、D组、E组、F组于停灌时立即截取心尖心肌，置液氮中冻存，测定时取出，采用高效液相色谱法(HPLC)测定心肌5’-三磷酸腺苷(ATP)、5’-二磷酸腺苷(ADP)、5’-一磷酸腺苷(AMP)含量，并计算腺嘌呤核苷酸总量(TAN)及能荷(EC)。同时，A组、B组中能复跳的心脏及C组停灌时的心尖心肌采用高效液相色谱/串联质谱联用法(LC-MS/MS)测定心肌组织中布比卡因浓度。
1.5??统计学处理方法??应用Stata 7.0统计软件行统计学处理。重复测量资料应用方差成分的混合模型进行统计分析。计数资料的比较采用卡方检验。非连续资料二组间的比较采用成组t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析。
2??结果
2.1??A组、B组心脏复跳情况??A组、B组所有离体大鼠心脏经灌入100μmol/L布比卡因后均造模成功。A组Ts为(44±12)s，B组Ts为(45±21)s秒，组间比较差异无显著性(P?&>0.05)。A组、B组复跳的例数分别为12例、5例，A组显著多于B组(P&<0.01)。3 min内复跳的例数A组、B组分别为12例、2例，A组显著多于B组(P&<0.01)。A组Tr为(41±14)s(n?=12)，B组Tr为(263±111)s(n?=5)，A组Tr显著短于B组(P&<0.05)。
2.2??A组、B组心脏停跳前及复跳后RPP变化??两组在Tb的RPP比较差异无显著性。两组RPP在T1～ T40各时间点均显著低于Tb(P?&<0.05或0.01)，A组的RPP在T1～T40各时间点显著高于B组(P&<0.01)，见图1。A组和B组的RPPh分别为：(28?053±5?871)mmHg·beats/min(n=12)和(9?749±770)mmHg·beats/min(n=5)，A组显著高于B组(P&<0.01)。A组和B组的RPPr分别为(64±9)%和(24±7)%，A组显著高于B组(P&<0.01)。
2.3??E组、F组心脏平衡末及继续灌注40 min期间RPP变化??E组的RPP在T10’～T40’各时间点显著低于Tb’(P&<0.05或0.01)，F组的RPP在T15’～T40’各时间点显著低于Tb’(P&<0.05或0.01)，两组的RPP在Tb’及T5’～T40’各时间点组间比较差异无显著性(P&>0.05)，见图2。
2.4??各组心脏停灌时心肌组织腺苷酸含量及能荷??A组与B组心肌ATP，ADP，AMP，TAN含量组间比较差异无显著性(P&>0.05)，A组的EC值显著低于B组(P&<0.05)。C组与D组比较、E组与F组比较ATP，ADP，AMP，TAN含量及EC值组间比较差异无显著性(P&>0.05)，见表1。
2.5??A组、B组、C组心肌组织中布比卡因浓度 ??A组、B组、C组心肌组织中的布比卡因浓度分别为：A组为(16.8±5.2)nmol/g，B组为(42.5±7.7)nmol/g，C组为(100.7±18.2)nmol/g，A组、B组、C组之间比较差异均有显著性，从高到低依次为C组&> B组&> A组(P?&<0.01)。
3??讨论
布比卡因所导致的心脏毒性一旦发生，复苏困难，致死率高。近年来国外有文献报道应用脂肪乳剂治疗布比卡因心脏毒性有效的动物实验[1-3]，但随后有文献质疑其有效性[8]。先前我们[4]建立了离体大鼠心脏布比卡因中毒模型，排除了神经、体液、内分泌等因素对心功能的影响，观察脂肪乳剂治疗布比卡因诱导的离体大鼠心脏停搏的复苏效应和对复苏后心脏功能的影响，认为脂肪乳剂解救布比卡因引起的心脏停搏有效。本研究探讨脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性可能的作用机制。
1998年Weinberg等[9]报道通过脂肪乳剂预处理使布比卡因致心脏毒性的剂量增加，并在实验中证实脂肪乳剂与血浆混合液的脂相中布比卡因浓度是水相的12倍。于是提出“脂质隔离”假说，推测输注脂肪乳剂可提供一种脂质吸附递质使脂溶性的布比卡因隔离在其中，相应减少布比卡因在血浆中的游离药物浓度。随后Weinberg等[10]报道输注脂肪乳剂能使与心肌细胞结合的布比卡因迅速解离而返回循环池中，心肌细胞的功能得以迅速恢复，即“洗脱效应”。但Stehr等[11]报道治疗剂量的脂肪乳剂对布比卡因的“脂质隔离”作用非常有限，并证明脂肪乳剂对左旋布比卡因抑制的离体心脏具有直接的正性肌力作用。我们的研究没有观察到脂肪乳剂对心脏有直接的正性肌力作用，但使用脂肪乳剂使心肌组织的布比卡因浓度显著下降，减少了布比卡因在心肌中的药物浓度，从而减轻了布比卡因对心脏肌力和传导的抑制，促进心脏复跳，并使心肌收缩力、心率和心电传导改善，研究证明了Weinberg等学者提出的“洗脱效应”学说。
有文献[3，12]推测脂肪乳剂可以改善心肌能量代谢，输入的脂肪乳剂可能通过增加细胞内的游离脂肪酸浓度，从而逆转局麻药对心肌细胞线粒体膜的肉毒碱脂肪酰转移酶(CACT)的抑制，恢复心肌细胞通过脂肪酸氧化产生ATP的能力。但布比卡因导致心脏停搏是急性反应，布比卡因致心脏停搏时心肌ATP含量、EC值并没有减少，可见高浓度布比卡因使心脏停搏不是由于心肌ATP含量减少、能量耗竭导致。甚至对照组的EC值反而较脂肪乳剂复苏组高，这是由于对照组心脏复跳后心功能差，心肌能量消耗少，心肌细胞内高能磷酸键的降解相对较少所致;而脂肪乳剂复苏组复跳后心肌作功多，导致心肌细胞能量储备减少。但无论是平衡末直接灌注脂肪乳剂，还是在布比卡因致心脏停搏后应用脂肪乳剂，均没有观察到脂肪乳剂增加心肌ATP含量、改善能荷的作用。Stehr等[11]也报道脂肪乳剂不影响心肌的能荷，这支持我们的观点。
总之，脂肪乳剂对布比卡因心脏毒性有确切的治疗作用。脂肪乳剂能降低心肌布比卡因浓度，使心肌细胞的功能得以迅速恢复，是其逆转布比卡因心脏毒性的主要作用机制。对脂肪乳剂逆转布比卡因心脏毒性的最佳治疗剂量尚有待进一步研究。
参考文献
[1] Di Gregorio G， Schwartz D， Ripper R， et al. Lipid emulsion issuperior to vasopressin in a rodent model of resuscitationfrom toxin-induced cardiac arrest[J]. Crit Care Med， 2009，37(3):993-999.
[2] Weinberg GL， Di Gregorio G， Ripper R， et al. Resuscitationwith lipid versus epinephrine in a rat model of bupivacaineoverdose[J]. Anesthesiology， 2008，108(5):907-913.
[3] Weinberg G， Ripper R， Feinstein DL， et al. Lipid emulsioninfusion rescues dogs from bupivacaine-induced cardiactoxicity[J]. Reg Anesth Pain Med， 2003，28(3):198-202.
[4] 刘乐，陈莺，徐旭仲，等. 脂肪乳剂对布比卡因诱导的离体大鼠心脏停搏的复苏作用[J].温州医学院学报， 2009，39(1):31-35.
[5] 王权光，刘乐，徐旭仲，等.脂肪乳剂对布比卡因中毒犬的血流动力学及药代动力学的影响[J].中华医学杂志，2009，85(25):1787-1790.
[6] 王权光，刘乐，徐旭仲，等. 脂肪乳剂对布比卡因心脏抑制犬血压、心率和心电图的影响[J]. 温州医学院学报，2009，39(3):220-222.
[7] 余立群，金梵梵，杨毅，等. 脑缺血预处理对离体大鼠心脏再灌注损伤的影响[J].温州医学院学报， 2005，35(4):271-273.
[8] Mayr VD， Mitterschiffthaler L， Neurauter A， et al. A com-parison of the combination of epinephrine and vasopressinwith lipid emulsion in a porcine model of asphyxial cardiacarrest after intravenous injection of bupivacaine[J]. AnesthAnalg， 2008，106(5):1566-1571.
[9] Weinberg GL， VadeBoncouer T， Ramaraju GA， et al. Pre-treatment or resuscitation with a lipid infusion shifts thedose-response to bupivacaine-induced asystole in rats[J].Anesthesiology，1998，88(3):1071-1075.
[10] Weinberg GL， Ripper R， Murphy P， et al. Lipid infusionaccelerates removal of bupivacaine and recovery frombupivacaine toxicity in the isolated rat heart[J]. Reg AnesthPain Med，2006，31(4):296-303.
[11] Stehr SN， Ziegeler JC， Pexa A， et al. The effects of lipidinfusion on myocardial function and bioenergetics in l-bupivacaine toxicity in the isolated rat heart[J]. Anesth Analg，2007，104(1):186-192.
[12] Weinberg G. Lipid Rescue Resuscitation from Local Anaes-thetic Cardiac Toxicity[J]. Toxicol Rev，2006，25(3):139-145.