不同浓度rhEPO对神经干细胞体外培养增殖的影响

　　　　 作者：胡萌，吕刚，梅晰凡，张世民

【摘要】 目的 观察不同浓度rhEPO对神经干细胞体外培养增殖的影响，探讨rhEPO联合神经干细胞移植治疗脊髓损伤修复的影响。方法 用不同浓度(5、50、500 U/mL)rhEPO干预从新生SD大鼠(出生24 h以内)取材来的神经干细胞，分别检测每组神经干细胞克隆形成率;在不同时间分别用MTT法检测细胞增殖率;神经干细胞分化的免疫细胞化学染色及计数。结果 添加rhEPO各实验组细胞增殖较快最终神经球的数量多于对照组，以50 U/mL rhEPO组作用显著;添加rhEPO各实验组的细胞生长曲线均高于对照组，尤其是50 U/mL rhEPO组显著高于对照组;NSE和GFAP免疫细胞化学染色和计数结果显示，50 U/mL rhEPO组中NSE免疫阳性细胞明显多于对照组(P&<0.01)。结论 rhEPO对神经干细胞体外培养增殖有促进作用，尤以适中浓度(50 U/mL)作用更加明显。

【关键词】 神经干细胞;rhEPO;体外培养;增殖

　　　　Abstract: Objective To observe the effect which multiplies in vitro raise to the nerve stem cell of different density rhEPO， and to discuss the influence of rhEPO， associated with nerve stem cell transplant， in curing spinal cord damage repair. Methods The present research firstly intervened the nerve stem cell， obtained from the newborn SD big mouse (born within 24hs)， with different density rhEPO (5， 50， 500 U/mL). Then， a distinctive examination of the rate of clone formation in each groups nerve stem cells was conducted. Afterwards， MTT method was used to examine the cell reproducibility in different times and nerve stem cell differentiations immunocytochemistry dyeing and counting. Results The cell multiplication in experimental groups which had added the EPO was quicker and the quantity of final nerve balls was larger than that in the control group， which was remarkable in 50 U/mLEPO group. The cell growth curve in experimental groups which had added the rhEPO was higher than that in the control group， which was also remarkable in 50 U/mL EPO group. The NSE and GFAP immunocytochemistry dyeing and the counting results showed that the NSE immunity masculine cells in the 50 U/mL EPO group were obviously more than that in the control group (P&<0.01). Conclusions rhEPO has the positive effect on the nerve stem cell in vitro raise multiplication， which is more obvious with the moderate density (50 U/mL).

　　Key words:nerve stem cell; rhEPO; in vitro raise; multiplication

　　神经干细胞(nerve stem cell，NSCs)是一种具有复制能力和多向分化潜能的原始细胞，在中枢神经系统损伤的修复研究中逐渐引起医学界的关注。近年来的研究发现，神经干细胞不仅存在于 胚胎脑组织，而且已发育成熟的 内也存在神经干细胞[1]。正常情况下这些NSCs处于“静止”或“休眠”状态，在特定因素的作用下，例如损伤或刺激，其分裂、分化的潜能就被激活，从而出现增殖现象。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对离体神经干细胞具有一定的增殖效应，但其作用有限[2]。因此，如何更有效的促进NSCs的增殖是推动其在治疗过程中的重要方法。本实验对重组人促红细胞生成素(rhEPO)和bFGF联合应用促进NSCs的体外增殖效应进行初步探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　新生SD大鼠(出生24　h以内)、DMEM/F12培养基、无血清培养添加剂B27(美国Gibco)、bFGF(北京双鹭生物制品公司)、EGF(premega公司)、胰蛋白酶、谷氨酰胺(Sigma)， MTT(噻唑兰)、DMSO(二甲基亚砜)，及其他相关试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 神经干细胞的原代培养

　　①新生SD大鼠经75%酒精消毒，无菌条件下将前脑完整取出，借助显微镜在视交叉平面和海马平面各做一道冠状切口，留取自视交叉至海马约2 mm厚的脑块。将留取的脑块冠状面朝上放置，然后在侧脑室外侧做两道矢状切口，并且在胼胝体上方做一水平切口，留取中间围绕侧脑室前角的脑块。此部位包含侧脑室前角室下带(subventricular zone，SVZ)，富含神经干细胞。②去除软脑膜和脉络丛组织。将脑组织转移到另一培养皿，用剪刀反复剪切至约1 mm3大小组织块，加入DMEM/F12基础培养基2～3 mL，用吸管反复吹打，制成细胞悬液。③将细胞悬液用200 目铜网过滤，去除残留未分散组织，将滤液移入无菌10 mL离心管。离心机将过滤的细胞悬液以1 000 r/min离心10 min，以便收集细胞。④吸管小心吸除上清液体，将沉淀的细胞重悬于2 mL含B27和20 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基中，计数板计数后以2～5×105个细胞/mL接种于25 cm3 培养瓶。置37 oC，5%CO2培养箱内培养。⑤培养4～5 d后，将含细胞的培养液转移至离心管中，1 000 r/min离心10 min，收集细胞。同样方法小心吸除上清液体，用相同培养液重悬细胞后，接种于更换的培养瓶中，继续培养。每5～7天换液1次。⑥培养2周左右时见神经干细胞克隆形成，3～4 周见大量神经干细胞球。以后用机械法分散神经球方法进行传代培养。

　　1.2.2 神经干细胞的传代培养

　　将细胞移入无菌10 mL离心管，以1 000 r/min转速离心10 min，收集细胞。吸除上清液体，向沉淀中加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶/EDTA(1：1)消化液，37 ℃水浴5 min。用吸管轻轻吹打成单细胞悬液(此步骤时间不超过5 min)。加入1/10体积的血清终止消化。以2～5×105个细胞/mL细胞浓度继续培养，培养基成分同上。

　　1.3 实验分组

　　取第3代神经干细胞制备单细胞悬液，分别接种于含rhEPO 5、50、500 U/mL的无血清培养基中，同时设不含rhEP0的对照组，其中实验组、对照组无血清培养基含bFGF浓度均为20 ng/mL。将各组神经干细胞悬液置于5%CO2、37 ℃培养箱内培养。每组均设复孔，实验重复3次。

　　1.4 检测指标

　　1.4.1 检测神经干细胞克隆形成率

　　将各组细胞作梯度倍数稀释接种于25 cm3培养皿中静置培养。细胞培养7 d时，取对照组和各实验组培养皿放置在一张带网格的透明胶片上，在倒置显微镜下计数克隆数，计算公式如下:

　　克隆形成率(%)=单位面积克隆数/单位面积接种细胞数×100。

　　1.4.2 MTT法检测细胞的活性

　　将各组细胞以每孔大约1.0×105个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积150 μL，每日检测OD值。

　　1.4.3 神经干细胞分化的免疫细胞化学染色及计数

　　将各组神经干细胞接种于6孔培养板中(预先置有涂多聚赖氨酸的盖玻片)，每孔平均接种50 个神经球，加入有血清培养基3.0 mL，静置培养，每3天换液。10 d后收集贴有细胞的盖玻片，分别做NSE、GFAP免疫细胞化学染色。每个标本随机取20 个视野，普通光镜下观察并计数每个视野的阳性细胞数占细胞总数的百分率，取平均值。

　　1.5 统计分析

　　数据以±s表示，采用SPSS统计学软件处理，各组率的比较采用χ2检验法，各组均数比较采用方差分析及q检验。

　　2 结 果

　　2.1 细胞的观察及克隆形成率检测结果

　　对照组形成的神经球数量无明显变化，神经球的细胞折光性较弱，边缘细胞形态不规则，可见有丝絮状物和较多细胞碎片。而添加rhEPO各实验组细胞增殖较快，48　h可见较多的成对或3～5成群细胞出现，最终神经球的数量多于对照组，以50 U/mL rhEPO组作用显著。

　　2.2 MTT检测结果

　　MTT结果显示，添加rhEPO各实验组的细胞生长曲线高于对照组，尤其是50 U/mL rhEPO组显著高于对照组。

　　2.3 细胞分化比例检测及显微测量结果

　　对照组神经球贴壁率低，可见许多细胞团漂浮在培养基中，最终漂浮的细胞团变为细胞碎片。添加rhEPO各实验组中，部分神经球贴壁困难，一旦神经球贴壁，随即有突起长出，胞体和突起生长较快，双突起和多突起细胞多于对照组，第2　d即可见部分细胞建立突触联系。3　d细胞多数可形成较密集网络，胞体较丰满，细胞突起生长快，可见多角形细胞。对照组细胞网络稀疏，细胞胞体较小，突起变短、变粗，有的胞体内可见空泡。显微测量结果显示，50 U/mL rhEPO组中细胞突起长度显著高于对照组(P&<0.01)。

　　NSE和GFAP免疫细胞化学染色和计数结果显示，50 U/mL rhEPO组中NSE免疫阳性细胞明显多于对照组(P&<0.01)。

　　3 讨 论

　　最近的研究证实，rhEPO在体内和体外的多种神经细胞损伤模型中均有抗凋亡作用。在运动神经元培养中，rhEPO能抑制因血清缺乏或红藻氨酸诱导的细胞凋亡。神经细胞rhEPO受体激活后，通过干扰JAK2和核转录因子可抑制N-甲基-D-天(门)冬氨酸(NMDA)和NO诱导的凋亡[3]。rhEPO还可以通过调节凋亡过程中不同基因的表达发挥抗凋亡作用。在自由基损伤模型中，rhEPO可调节神经膜外部分的磷脂酰丝氨酸(PS)残基，并通过调节线粒体的膜电位和细胞色素C的释放以及caspase8、caspase1和caspase3活化酶的活性，增加丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)的活性，促进凋亡的蛋白磷酸化而保持DNA的完整性[4]。rhEPO在神经系统内抑制细胞凋亡的机制可能与在红细胞内的机制相同。

　　rhEPO对神经细胞的许多功能活动均具有调节作用，例如钙离子外流、膜的去极化、神经递质的合成以及细胞的凋亡等。rhEPO可能通过抑制或刺激神经递质的合成来参与突触可塑性的调节。在PC12细胞中，rhEPO通过激活钙离子通道刺激多巴胺的释放和酪氨酸羟化酶的活性，诱导膜的去极化，增加一氧化氮(NO)的合成，促进神经递质(r-氨基丁酸、乙酰胆碱和多巴胺等)的释放[5]。在大鼠脊髓损伤和坐骨神经损伤模型中，rhEPO能通过对突触传递的直接作用而起到伤后即刻的神经保护作用。

　　在海马薄片培养中，rhEPO受体被激活后，通过激活JAK2抑制钙离子介导的兴奋性氨基酸释放来实现对神经元缺血的保护。最近有报道显示，rhEPO能刺激T型电压依赖性钙通道的活性，人类成神经细胞瘤的膜片钳研究证实，有T型钙通道的表达。当把 rhEPO加入到培养基中，可以观察到钙通道的最大峰值电流增加。因此，rhEPO可以通过胞膜上的T型电压依赖性钙通道增加钙离子流，进而影响神经细胞内钙离子的平衡来产生对神经细胞的保护作用[6]。

　　rhEPO的作用并不仅限于直接影响细胞的生存，在细胞培养中也展示了其营养作用。rhEPO能启动细胞的分化，阻止细胞的死亡和增强胆碱乙酰基转移酶的活性。这些发现说明，rhEPO抑制神经元凋亡是其短暂的作用，对神经元的营养作用则是长期的。

参考文献

[1] Romero MI，Lin L，Lush ME，et al. Deletion of Nf1in neurons induces increased axon collateral branching after dorsal root injury[J]. Neurosci，2007，27(8):2124-2134.

　　[2] Karimi-Abdolrezaee S，Eftekharpour E，Wang J，et al. Delayed transplantation of adult neural precursor cells promotes remyelination and functional neurological recovery after spinal cord injury[J].Neurosci，2006，26(13):3377-3389.

　　[3] Yamanaka H，Obata K，Kobayashi K，et al. Alteration of the cell adhesion molecule L1 expression in a specific subset of primary afferent neurons contributes to neuropathic pain[J].Fur J Neurosci，2007，25(4):1097-1111.

　　[4] Baharvand H，Mehrjardi NZ，Hatami M，et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture condition[J].Int J Dev Biol，2007，51(5):371-378.

　　[5] Hu YF，Zhang ZJ，Sieber-blum M.An epidermal neural crest stem cell(EPI-NCSC) molecular signature[J].Stem Cells，2006，24(12):2692-2702.

　　[6] Lim DA，Tramontin AD，Trevejo JM，et al. Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis[J].Neuron，2000，28(3):713-726.