伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备

　　　　作者：张海方 高宇琳 黄新祥 生秀梅 徐顺高 许化溪

【摘要】 目的： 克隆表达H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66，并纯化制备相应的多克隆抗体。方法： 利用PCR 技术从H:z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB:z66，将该基因克隆到表达载体pET28a(+)上并在大肠埃希菌JM109中进行表达;fljB:z66的表达产物经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备多克隆抗体。结果： 经PCR及序列分析证实，伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66 被成功导入表达载体pET28a(+)，并在大肠埃希菌JM109中获得了高效表达，以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体。结论： 成功克隆表达了H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66，并制备了相应的多克隆抗体，为今后深入研究H:z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制奠定了基础。

【关键词】 伤寒沙门菌; fljB:z66; 多克隆抗体

　　[Abstract] Objective: To clone and express the flagellin gene fljB:z66 of H:z66 positive Salmonella enterica serover Typhi， and prepare the antiz66 polyclonal antibodies.Methods： Specific primers were designed to amplify the flagellin gene fljB:z66 from the chromosome DNA of H:z66 positive Salmonella enterica serover Typhi GIFU10007.The amplicon was inserted into the expression vector pET28a(+)， which was then transferred to E.coli JM109 to be expressed.The recombinant protein FljBHis6 was purified with NiTED packed column and was used as immunogen to prepare the polyclonal antibody.Results： PCR and sequencing analysis demonstrated that the flagellin gene fljB:z66 of H:z66 positive Salmonella enterica serover Typhi was inserted into the vector pET28a(+) and was expressed highly in E.coli JM109.The rabbit antiz66 polyclonal antibody was prepared successfully.Conclusion： This study was a foundation to research the mechanism underlying the the unidirectional flagellar phase variation of H:z66 positive Salmonella enterica serover Typhi.

　　[Key words] Salmonella enterica serover Typhi; fljB:z66; polyclonal antibody

　　伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi)是沙门菌属中一种重要的人类肠道致病菌。鞭毛(flagella)是细菌的动力装置，也是沙门菌的一种重要毒性因子[1]。沙门菌鞭毛可分为基体、弯钩和细丝三部分。基体部被包埋在细菌内外膜中，有中央小管。细丝部在菌体外侧通过弯钩部和基体部相连，主要由一种称之为鞭毛素(flagellin)的蛋白质构成。大多数的鞭毛抗原血清型如鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)有两种不同的鞭毛素编码基因，位于染色体不同部位，称之为两相菌株(biphasic strain)，常以fliC和fljB表示其一、二相鞭毛素基因。

　　1981年Guinee等[2]在伤寒沙门菌中发现一种新的z66鞭毛抗原。2004年Huang等[3]发现伤寒沙门菌z66抗原的编码基因具有二相鞭毛素基因的结构特征，即存在fljBA样基因簇结构。H:z66阳性伤寒沙门菌只能从z66抗原表达转为d或j抗原表达，为单向不可逆变化[4]。最近研究表明，z66抗原的编码基因位于一罕见的线性质粒中，而且这种单向相变换是与缺失了线性质粒含fljBA的2.7 kb末端区域有关[5， 6]，但造成这种缺失的机制尚不明确。我们推测鞭毛与相应的抗体结合后，可以启动胞内一系列基因表达调节，最终通过某些关键基因的表达改变，致线性质粒缺失含fljBA的部分结构而实现鞭毛表达的相变换。本研究旨在克隆表达H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66，并制备其相应的多克隆抗体，为深入研究H:z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制提供必要的条件。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌种和质粒 野生型伤寒沙门菌GIFU10007，E.coli JM109(DE3) 、质粒pET28a(+)、一相鞭毛素伤寒沙门菌Ty2均由本室保存。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 DNA聚合酶pfu、限制性核酸内切酶BamH Ⅰ，Xho Ⅰ和T4DNA连接酶购自宝生物工程有限公司(大连， TaKaRa);IPTG，dNTP和DNA胶回收试剂盒购于Promega公司;其他试剂均为进口或国产分析纯。核酸紫外检测仪(Eppendorf Biophotometer)，PCR仪(AB I 2700)，凝胶成像系统(Gene Genius BIO IMAGING SYSTEM)，蛋白电泳仪(Biorad)，离心机，超声破碎仪。

　　1.1.3 实验动物 新西兰大白兔2只，由江苏大学实验动物中心提供。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66的获得 根据从基因库中检索到的fljB:z66基因序列，利用引物设计软件设计了上、下游引物PfljB:z66A和PfljB:z66B，并分别在5′端添加BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点序列。

　　PfljB:z66A：GCGGATCCATGGCACAAGTCATTAATAC(下划线为BamHⅠ酶切位点)

　　PfljB:z66B：AACTCGAGACGCAGCAGAGACAGTAC(下划线为Xho Ⅰ酶切位点)。挑取GIFU10007菌落，加1 ml超纯水，沸水浴10 min后离心，上清液中即含基因组，以此作为模板，以fljB:z66基因上、下游引物PfljB:z66A和PfljB:z66B为引物，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因，并用1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。

　　1.2.2 重组载体的构建与鉴定 用DNA胶回收试剂盒回收PCR 产物，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ同时双酶切PCR回收产物和表达载体pET28a(+)，酶切产物用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后， 用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物用热激法转化至大肠埃希菌DH5α。挑取若干连接产物转化菌单菌落，分别划线接种于加有氨苄西林的LB平板上，37 ℃培养6 h后，收集上述菌体和空载体转化菌体于30 μl 纯净水中，震荡混匀后加等体积的酚/氯仿抽提、离心，上清10 μl上样，0.7%琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小，筛选阳性克隆质粒。提取阳性克隆质粒，采用双酶切和PCR方法鉴定阳性克隆，再通过DNA序列分析以最终确认(序列分析由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。阳性克隆质粒热激法转化至大肠埃希菌JM109，具体方法

参考文献

[7]。

　　1.2.3 大肠埃希菌表达fljB:z66条件的优化 挑取新鲜的含重组质粒pET28a(+)fljB:z66的大肠埃希菌JM109单菌落及含空质粒pET28a的对照大肠埃希菌JM109单菌落分别置于1 ml LB 培养液中(氨苄西林100 μg/ml)，37 ℃振摇过夜，次日将饱和菌液以1∶100稀释度加入4 ml LB 培养液中37 ℃振摇2～3 h后至D(600 nm)为0.5～0.8，加入IPTG 至终浓度分别为0.2，0.5，1 mmol/L，分别于30℃ 和37 ℃继续振摇4 h进行诱导后，10 000 r/min 离心5 min，沉淀悬于100 μl TE 溶液中4 ℃超声破碎后离心(12 000 r/min，15 min)，收集上清液进行SDSPAGE。

　　1.2.4 表达蛋白的纯化 在上述表达的优化条件下200 ml菌体培养液离心收集菌体，用PBS(pH7.2)洗涤2 次，按照每克菌(湿重)加入10 ml 过柱缓冲液(20 mmol/L TrisHCl，pH7.4;200 mmol/L NaCl;1 mmol/L EDTA) 的比例重悬菌体，超声破碎后离心(4 ℃，12 000 r/min，30 min) 收集上清液(粗提物)。用过柱缓冲液稀释粗提物至10 mg/ml的浓度，以1 ml/min流速上样稀释的粗提物于Ni柱中。用12 倍柱床体积的过柱缓冲液冲洗柱，移除未结合的蛋白;用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。EP管收集洗脱液，每管1 ml，共收集10管，用紫外分光光度计检测各管在280 nm处的光密度。取收集的各管纯化上清10 μl加等体积的2 ×样品缓冲液，沸水浴10 min，进行SDSPAGE。

　　1.2.5 兔抗Z66多克隆抗体的制备 合并收集的纯化上清，经PBS透析后，用等体积弗氏完全佐剂乳化，按每只兔50 μg抗原剂量，1 ml每只，背部皮下多点注射，同时肌肉注射百日咳疫苗0.5 ml。之后，每隔2周用弗氏不完全佐剂与抗原溶液以1∶1比例乳化，剂量减半加强免疫一次，共加强4次，末次免疫2周后颈动脉放血制备抗血清。抗血清通过硫酸铵盐析再经透析除盐等步骤制备初步纯化的兔抗Z66多克隆抗体，分装后-20℃保存备用。ELISA测定抗体的效价，抗体与野生型伤寒沙门菌GIFU10007全菌蛋白进行Westernblotting以检测抗体的特异性。

　　2 结 果

　　2.1 伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66的表达载体的构建

　　以GIFU 10007 为模板，PCR扩增获得了与预期大小相符的1 467 bp的DNA片段。将该片段用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后克隆到表达载体pET28a(+)上，转化至大肠埃希菌DH5α，得到转化子，所携带的质粒命名为pET28a(+)fljB:z66。提取该质粒，经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切可以得到约1 467 bp的外源片段，大小与PCR 产物一致(图1)，这说明表达载体pET28(a)上成功地连接上长约1 467 bp的fljB:z66基因。

　　2.2 重组蛋白的表达与纯化

　　伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66在大肠埃希菌JM109中实现了表达，在不同温度和不同浓度的 IPTG 诱导下，蛋白表达量有一定的差异。在最佳的条件即37℃，IPTG终浓度为1 mmol/L进行诱导4 h，表达的蛋白主要在上清中，上清经Ni柱纯化获得FljBHis6，结果见图2，第7泳道即为纯化的FljBHis6。

　　M：低相对分子质量标准蛋白; 1：空菌全菌蛋白; 2：空质粒转化子全菌蛋白; 3：重组表达菌全菌蛋白;4：重组表达菌包涵体;5：重组表达菌上清;6：Ni柱纯化FljBHis6的穿梭液;7：Ni柱纯化FljBHis6

　　图2 FljBHis6蛋白表达及纯化的SDSPAGE

　　Fig 2 SDSPAGE analysis of FljBHis6 protein

　　expression and purifucation

　　2.3 兔抗z66多克隆抗体的制备

　　将经Ni柱纯化的FljBHis6免疫兔制备兔抗z66多克隆抗体，ELISA测定纯化后的抗体效价为1∶20 000，Westernblotting显示纯化后的抗体与抗原反应的特异性良好(图3)。

　　3 讨 论

　　沙门菌的鞭毛素蛋白单体多为50～60 ku，多肽中央约100个氨基酸残基的区域具有高度可变性，空间结构位于细丝外表，为鞭毛(H)抗原的决定区[8]。血清学检查已发现有近100种不同的沙门菌H抗原，被命名为a至z和z1至zN。据H抗原和菌体(O)抗原特性，已有2 200多种沙门菌的血清型被发现。大多数的血清型为两相菌株，如鼠伤寒沙门菌，在二相鞭毛素基因fljB下游紧邻的fljA是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因，fljA可在转录后水平上抑制FliC的表达;在fljBA的上游，存在一特殊的巨型发夹样结构(hix)包括了fljBA的部分启动区域;发夹样结构中还有一编码重组酶(recombinase)的hin基因，Hin可帮助调节该发夹环部结构的方向，从而影响fljBA启动区域方向的正确性，如“开关”样控制fljBA的表达，因而在任何时候只有一种鞭毛素蛋白得以表达[9]。

　　我们的研究表明H:z66阳性伤寒沙门菌是一特殊两相沙门菌，在二相鞭毛素基因fljB:z66下游紧邻着一fljA样基因[3]。最近我们证实了fljA样基因也是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因[10]。H:z66阳性伤寒沙门菌在抗H:z66鞭毛抗体诱导下能发生从fljB:z66到fliC:d/j的单向性鞭毛相变换，这种单向不可逆变化被证实是由于缺失了线性质粒含fljBA的2.7 kb末端区域有关[6]，但造成这种缺失的机制至今尚不明确。最近的研究表明鞭毛可作为鼠伤寒沙门菌的外部特殊感受器，感受环境湿度和温度，发挥对自身鞭毛基因的表达调节作用[11， 12]。据此，我们推测伤寒沙门菌的鞭毛可作为一种特殊的外部感受器，与相应的抗体结合后，介导胞内一系列基因表达调节，实现这种单向性鞭毛相变换。为了证实这种推测，我们需要体外用抗z66的抗体来诱导伤寒沙门菌的这种单向相变换，本研究通过鞭毛素基因fljB:z66的克隆与表达获得大量鞭毛素蛋白，以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体，为下一步研究奠定了基础。

参考文献

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