幽门螺杆菌CagPAI hp0523基因的克隆及功能预测

　　　　 作者：邵世和 钟桥 黄世腾 韩军 黄河 田树伟

【摘要】 目的： 明确幽门螺杆菌CagPAI hp0523基因的功能，探讨其在幽门螺杆菌致病中的作用。方法： 设计引物，以幽门螺杆菌NCTC11637为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段；将其进行TA克隆后，进行测序。将该基因序列与其他菌株做BLAST比对分析，并结合生物信息学数据库和软件，分析其序列特征和理化特性。结果： 经酶切，测序分析表明，插入的基因片断为510 bp，与基因库公布的幽门螺杆菌 26695及J99序列相比较，同源性高达 94%；软件预测其编码的蛋白为169个氨基酸，其相对分子质量约为19.7 kDa，等电点约为9.53；基序分析表明，在33～165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序，可能是溶菌糖基转移酶；对其催化能力进行预测，结果表明，HP0523（33.7%）催化能力可能较T4溶菌酶（32.3%）和溶菌酶SLT70（28.6%）的活性高。结论： 成功克隆了幽门螺杆菌CagPAI的hp0523基因，对其序列进行了深入分析，为进一步研究其功能，阐明幽门螺杆菌CagPAI的致病机制奠定了基础。

【关键词】 幽门螺杆菌； Cag致病岛； 功能预测； 溶菌糖基转移酶

　　［Abstract］ Objective: To analyze the function and the role of hp0523 gene in Helicobacter pylori(H.pylori) CagPAI for pathogenicity; Methods： Polymerase chain reaction(PCR) was used to amplify the hp0523 gene from H.pylori NCTC 11637， and then cloned into the pGEMTeasy plasmid and sequenced.Use the bioinformation databases and tools to analyze the information and properties of the target sequence. Results： Sequence analysis suggests that this fragment with 510 bp and encoded 169 aa which experiences a relative molecular weight at 19.7 kDa and isoionic point was at 9.53.The identity of this gene was 94% approximately in H.pylori strains 26695 and J99.Motif analysis suggests that it may be lytic transglycosylase， which harbored a conserved catalysis domain between 33 to 165 sites in the target sequence.From the general acidbase catalysis potential suggest that HP0523(33.7%) with a higher catalysis activity than T4 lysozyme(32.3%) and SLT70(28.6%). Conclusion： The hp0523 gene was cloned from H.pylori NCTC11637 successfully， and provide a solid base for the research on the pathogenicity mechanism of H.pylori CagPAI.

　　［Key words］ Helicobacter pylori； Cag pahogenicity island； functional prediction； lytic transglycosylase

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， H.pylori）是重要的胃肠道致病菌，其感染在世界范围内流行，全球感染率达50％以上，其中包括我国在内的发展中国家感染率高达80％以上，已成为危害我国公共卫生安全的重大问题［1］。流行病学研究表明，CagA和VacA是以中国为代表的东方菌株中的主要毒力因子［2］。编码CagA的Cag致病岛（CagPAI）是由约27个编码基因组成，大小约为40 kb。目前针对CagPAI的研究，主要集中在CagA毒性机制，特别是其转运后诱导的一系列细胞损伤及其信号传导的变化［3］。然而对于负责其转运的转运装置研究较少。其中，hp0523基因被认为可能参与CagA蛋白的转运，但其具体功能尚不清楚。鉴此，本研究采用基因工程的方法，克隆获得了CagPAI编码的hp0523基因；并利用生物信息学技术，对其序列特征进行深入分析，旨在进一步研究hp0523基因的功能，为阐明CagPAI编码的Ⅳ型样分泌装置转运机制奠定基础。

1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株 H.pylori NCTC11637由中国疾病控制中心传染病预防研究所张建中教授馈赠，大肠埃希菌DH5α为江苏大学基础医学与医学技术学院中心实验室保存。

　　1.1.2 主要试剂 哥伦比亚培养基、厌氧袋（OXOID公司）；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶EcoR I， Xho I及T4 DNA连接酶、DL2000 DNA标准参照物（Takara公司）； pGEMT 载体（Promega公司）；绵羊血（杭州天和生物公司）；胶回收试剂盒（上海捷瑞生物公司）。

　　1.1.3 主要仪器 核酸紫外检测仪（Eppendorf Biophotometer）；PCR仪（Eppendorf）；凝胶成像系统（Genius）。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 幽门螺杆菌的培养与鉴定 将H.pylori NCTC11637接种于含10％羊血的哥伦比亚平板上，微需氧培养72 h。从固体培养基上刮取生长状态良好的H.pylori菌落， 移入1.5 ml Eppendorf管，用适量PBS缓冲液洗涤沉淀物2～3次，离心收集细菌。基因组DNA提取参照《分子克隆》酚氯仿提取DNA法的步骤进行。

　　1.2.2 PCR扩增 根据hp0523基因的全长序列，设计上、下游引物:P1: 5′CGGGAATTCTTGTTTGGGAAATGGAT3′；P2: 5′ATTCTCGAGCTACTCGTTATATCGCACTT3′，在其5′端分别引入EcoR I，Xho I酶切位点，PCR 产物长度为510 bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。以H.pylori NCTC11637菌株基因组DNA为模板，用Ex Taq聚合酶进行PCR扩增（25 μl反应体系）。扩增参数为：94°C 5 min， 94°C 30 s，52°C 30 s，72°C 1 min，30个循环，72°C 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

　　1.2.3 TA克隆与测序分析 胶回收的PCR产物与pGEMT 载体，加1 μl T4 DNA连接酶，4°C连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。转化后的细菌涂布于含50 μg/ml氨苄西林的LB平板上，37°C培养16 h。挑取菌落转种于含氨苄西林50 μg/ml的LB液体培养基，37°C 振摇12 h，用碱裂解法进行质粒提取，并进行EcoR I，Xho I双酶切鉴定。酶切鉴定正确后的pGEMThp0523，送上海生工生物公司进行测序。

　　1.2.4 序列分析 基因序列的翻译、蛋白相对分子质量预测、等电点预测以及信号肽预测等，均使用EXPASY数据库在线预测分析软件。BLAST分析，采用美国国家生物信息研究中心NCBI数据库，BLASTp分析工具条；蛋白基序分析，采用Sanger研究所PFAM数据库预测。

　　2 结 果

　　2.1 hp0523基因的克隆

　　PCR结果显示在510 bp左右有一条带，与预计大小一致，无非特异性条带（图1a）。将PCR产物与pGEMT载体连接产物转化至DH5α，随机挑取菌落，抽提质粒，双酶切产物电泳后，阳性克隆出现的两条带分别位于约3 003 bp和510 bp处（图1b）。

　　2.2 HP0523蛋白的理化特性预测

　　hp0523基因510 bp，共编码169个氨基酸；蛋白质相对分子质量为19.7 kDa，其等电点为9.53。信号肽预测分析表明未能检测到，可能其分泌不通过传统的分泌途径，如Sec途径，TAT途径等。

　　2.3 hp0523基因在不同菌株间同源性比较

　　幽门螺杆菌NCTC11637的hp0523基因与26695，J99相比，同源性94％（图2）。幽门螺杆菌NCTC11637 hp0523基因序列在基因库登录号为EU000384。

　　2.4 序列分析与功能预测

　　采用基序搜索分析表明，在氨基酸33位到165位，存在一个保守的SLT催化域，可能发挥溶菌转移酶样作用。从NCBI数据库，检索获得不同细菌分泌系统中溶菌糖基转移酶的基因序列，采用clustalX 1.8将这些催化区域进行多重序列比较分析后，利用GenDoc软件显示结果。结果如图3所示，序列之间具有一定的保守性。二级结构分析表明，具有7个α螺旋区组成。其中，在第1个α螺旋区的尾端，存在1个谷氨酸GLU56，可能是发挥催化功能的活性位点。

　　从NCBI数据库搜索获得以下氨基酸序列：Hpa2(AAM40539)，HpaH(AAL78295)，hrp(CAD17992)，YsaH(AAF82325)，iagB(AAL21757)，ipgF(CAC05810)，ORF169(BAA97940)以及HP0523(AAF80194)；图中黑色阴影部分表示，具有高度同源性序列，其中▲表示该酶催化活性中心的氨基酸。

　　根据酶的酸碱催化特点，计算广义酸碱氨基酸的含量，比较其催化能力大小，结果见表1。HP0523的广义酸碱氨基酸比值（33.7%）较SLT70（28.6%）和T4L（32.3%）高，可能因为其酶活性较高。表1 蛋白质广义酸碱氨基酸催化能力比较

　　蛋白比值a(%)来源基因库登录号HP052333.7幽门螺杆菌；Ⅳ型分泌装置本研究VirB1_B23.1布氏杆菌；Ⅴ型分泌装置Q9RPY4VirB1_A26.4根瘤农杆菌；Ⅳ 型分泌装置AAZ50518HpaH31.8野油菜黄单胞菌；Ⅲ型分泌装置Q8RJP7ipgF37.5宋内志贺菌；Ⅲ型分泌装置Q55287Ysah38.5小肠结肠炎耶尔森菌； Ⅲ型分泌装置Q9KKJ1ORF16932.5E.coli F质粒；质粒结合装置P47737SLT7028.6E.coli；可溶性溶菌糖基转移酶1QSAAT4L32.3肠杆菌T4噬菌体; T4溶菌酶P00720　　　　 a：广义酸碱催化氨基酸含量，是指Glu， Asp， Lys， Arg， Tyr， Cys及 His占全部氨基酸的含量

　　3 讨 论

　　目前，利用生物信息学技术对未知基因进行序列分析和功能预测，已成为鉴定新基因的重要技术策略。本研究采用基因克隆的方法，从H.pylori NCTC11637中扩增获得hp0523基因，并对其序列进行功能预测［4］。结果表明，hp0523基因片断为510 bp，与基因库公布的幽门螺杆菌 26695及J99序列相比较，同源性高达94%。利用生物信息学软件预测其编码的蛋白为169个氨基酸，其相对分子质量约为19.7 kDa，等电点约为9.53。采用基序分析表明，在33～165位氨基酸之间存在一个保守的SLT催化基序。由此提示HP0523可能是溶菌糖基转移酶。

　　细菌细胞壁作为保护细菌自身的天然屏障，使分泌系统蛋白复合物的组装受到影响。因此，分泌系统中发挥溶菌功能的组分，如VirB1，ORF169等，在多蛋白复合物装配形成过程中起重要的作用［5， 6］。然而，这些溶菌糖基转移酶在氨基酸序列上存在着很大的差异，可能仅仅是部分序列发挥水解肽聚糖功能，如根瘤农杆菌VirB/D转运系统中VirB1。我们将不同细菌分泌系统中的溶菌糖基转移酶，利用PFAM数据库检索获得其发挥酶活性的保守功能域，进行多重序列之间的比对研究。结果表明hp0523基因和其他细菌分泌系统中溶菌糖基转移酶具有高度的同源性。其中，在α螺旋结构的末端存在一个保守的谷氨酸（Glu），可以形成一个催化的活性中心，发挥催化活性作用。结合SLT70的三维晶体结构研究表明，在溶菌糖基转移酶的氨基酸序列中还存在一个保守的AVGAY基序，可能是与肽聚糖结合作用的功能域［7］。通常，酶活性中心的一些基团作为质子的供体或质子的受体对底物进行广义的酸碱催化。广义酸碱氨基酸主要由Glu， Asp， Lys， Arg， Tyr， Cys及His组成，计算其在整个氨基酸序列中的比例，可以反应酶催化活性的大小［8］。从表2可以发现HP0523的广义酸碱氨基酸比例(33.7%)与T4溶菌酶(32.3%)一致，但高于SLT70(28.6%)。然而在A.tumefaciensⅣ型分泌系统（26.4%）与B.suisⅣ型分泌系统（23.1%）中的VirB1，较其他分泌系统的溶菌糖基转移酶要低。有文献报道称［9， 10］，在A.tumefaciens Ⅳ型分泌系统中的VirB1，可以水解产生一个VirB1片段，且该片段可能促进菌毛的形成；而在B.suis中，VirB1还可以和其他组分蛋白发生相互作用，促进其分泌装置的装配形成。

参考文献

［1］ Azuma T.Helicobacter pylori CagA protein variation associated with gastric cancer in Asia［J］.J Gastroenterol，2004， 39(2):97-103.

［2］ Dundon WG， de Bernard M， Montecucco C.Virulence factors of Helicobacter pylori［J］.Int J Med Microbiol，2001， 290(8):647-658.

［3］ Handa O， Naito Y， Yoshikawa T.CagA protein of Helicobacter pylori: a hijacker of gastric epithelial cell signaling［J］.Biochem Pharmacol，2007， 73(11):1697-1702.

［4］ 董苏荣，邵世和，殷秀杰，等.幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信息学特征预测［J］.江苏大学学报：医学版，2008，18(2):97-101.

［5］ Fullner KJ.Role of Agrobacterium virB genes in transfer of T complexes and RSF1010［J］.J Bacteriol，1998， 180(2):430-434.

［6］ Koraimann G.Lytic transglycosylases in macromolecular transport systems of Gramnegative bacteria［J］.Cell Mol Life Sci，2003， 60(11):2371-2388.

［7］ van Asselt EJ， Thunnissen AM， Dijkstra BW.High resolution crystal structures of the Escherichia coli lytic transglycosylase Slt70 and its complex with a peptidoglycan fragment［J］.J Mol Biol，1999， 291(4):877-898.

［8］ 王镜岩.生物化学［J］.3版.北京：高等教育出版社，2000：390-392.

［9］ Zupan J， Hackworth CA， Aguilar J， et al.VirB1* promotes Tpilus formation in the virType IV secretion system of Agrobacterium tumefaciens［J］.J Bacteriol，2007， 189(18):6551-6563.

［10］ Hoppner C， Carle A， Sivanesan D，et al.The putative lytic transglycosylase VirB1 from Brucella suis interacts with the type IV secretion system core components VirB8， VirB9 and VirB11［J］.Microbiology，2005， 151(11):3469-3482.