缺血预处理对大鼠缺血再灌注肾脏氧化亚氮合酶，L选择素表达的影响

　　　　作者：周留正， 孙浩， 贾俊海， 潘伟， 马尘超， 何悦成， 姜蓉瑛

【摘要】 目的： 观察缺血预处理后大鼠缺血再灌注肾脏氧化亚氮、氧化亚氮合酶水平和L选择素表达的变化，探讨肾缺血预处理对肾缺血再灌注损伤的影响。方法： SD大鼠30只，分为假手术组、缺血再灌注组、缺血预处理组，于手术后2小时取血、肾组织检测氧化亚氮（NO）含量、氧化亚氮合酶（NOS）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）活性，免疫组化法检测肾组织L选择素（Lselectin）的表达水平。结果： 缺血预处理组SOD活性明显高于缺血再灌注组（P&<0.01）， 缺血预处理组MDA含量明显低于缺血再灌注组（P&<0.01），缺血预处理组NOS，NO水平明显高于缺血再灌注组（P&<0.01），缺血预处理组L选择素表达明显低于缺血再灌注组（P&<0.05）。结论： 缺血预处理减轻肾缺血再灌注损伤的机制可能是增加NOS在血、肾脏的表达，抑制L选择素的表达，进而维持肾SOD活力，减少MDA含量。

【关键词】 缺血预处理； 肾缺血再灌注损伤； L选择素； 氧化亚氮； 氧化亚氮合酶

　　［Abstract］ Objective: To observe the change of NO， NOS and Lselectin expression in rat renal ischemic reperfusion injury after renal ischemic preconditioning and investigate the effect of ischemic preconditioning on renal ischemic reperfusion injury.Methods： Thirty SD rats were randomly pided into three groups: shamoperated group， ischemicreperfusion group，ischemic preconditioning group. The renal underwent 60minute ischemic and 2hour reperfusion. The level of Superoxide Dismutase(SOD)， Malondialdehyde(MDA)， NO， NOS of kidney， blood in each group were examined， Lselectin expression in kidney was tested with immunohistochemichemistry. Results： SOD: The values in ischemicpreconditioning group were significantly higher than that in ischemicreperfusion group(P&<0.01)， MDA: The values in ischemicpreconditioning group were significantly lower than that in ischemicreperfusion group(P&<0.01)， NOS，NO:The values in ischemicpreconditioning group were significantly higher than that in ischemicreperfusion group. The expression of Lselectin in ischemicpreconditioning group was lower than that in ischemicreperfusion group(P&<0.05). Conclusion： Ischemic preconditioning could protect kidney from ischemic reperfusion injury， the mechanism might be that it increased NOS in kidneys and blood， so that the expression of Lselection was inhibited， with improving the SOD′s activity and reducing the levels of MDA in kidney and blood.

　　［Key words］ ischemic preconditioning; kidney ischemic reperfusion injury; Lselectin; NO; NOS

　　缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， IRI)是临床常见问题，由预先短暂重复的缺血再灌注过程而诱导的对较长时间缺血再灌注损伤的自身保护作用，称之为缺血预处理（ischemic preconditioning），是缺血再灌注损伤最有效的内源性保护措施。而缺血预处理对器官的保护机制，仍未能完全阐明，可能涉及多种因素。本实验采用大鼠的肾脏缺血再灌注损伤模型，通过检测氧化亚氮(NO)、氧化亚氮合酶(NOS)和L选择素表达的变化，观察肾脏缺血预处理对肾脏缺血再灌注损伤的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　成年雄性SD大鼠30只，体质量250～300 g，由江苏大学医学院实验动物中心提供。主要试剂：NO、NOS、诱导型氧化亚氮合酶（iNOS)、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，L选择素多抗购自北京博奥森生物科技有限公司，即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 方 法

　　大鼠随机分成3组，即假手术组、缺血再灌注组和缺血预处理组。所有大鼠禁食12 h、不禁饮，采用5%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，切除右肾，分离出左肾动脉，以无创微血管夹夹闭左肾动脉造成肾缺血，松开后为再灌注。假手术组（n=10）：左肾动脉下方穿丝线；不再进行肾缺血手术，也不进行缺血预处理； 缺血再灌注组（n=10）：左肾持续缺血60 min，再灌注2 h； 缺血预处理组（n=10）：左肾先进行缺血5 min，再灌注5 min，连续4个循环，然后持续缺血60 min，再灌注2 h。所有大鼠于再灌注2 h后切取肾，肾组织冠状面剖开，形成大致相等的两块，一块冰生理盐水中匀浆测NO，NOS，SOD，MDA，另一块低聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，行免疫组化测L选择素的表达。开胸左心耳取血、离心，测血清NO，NOS，SOD，MDA。

　　1.3 免疫组化

　　肾组织石蜡切片，按武汉博士德生物工程有限公司提供的SABC即用型试剂盒说明书进行染色，以PBS代替一抗做阴性对照，显微镜下观察肾小球、肾小管染色情况。阳性为棕黄色颗粒，强阳性为深棕色，弱阳性为浅黄色；每张切片在400光镜下随机选择8个视野，用lecia图像分析系统进行分析，测定每个视野的光密度（视野光度/背景光度×100％），用平均值表示阳性染色强度。

　　1.4 统计方法

　　所有测得的指标采用均数±标准差（±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 MDA，SOD含量测定结果

　　缺血再灌注组MDA含量明显高于假手术组（P&<0.01），SOD水平明显低于假手术组（P&<0.05）。缺血预处理组MDA含量明显低于缺血再灌注组（P&<0.05），SOD水平明显高于缺血再灌注组（P&<0.05）。见表1。

　　2.2 NO，NOS水平测定结果

　　无论血清NO，TNOS，iNOS，还是肾组织NO，TNOS，iNOS，缺血再灌注组均明显低于假手术组，差异有统计学意义（P&<0.05）；而缺血预处理组上述指标高于缺血再灌注组，且具有统计学意义（P&<0.05）。见表2。表1 各组血清、肾脏MDA和SOD的测定结果 与假手术组相比，a: P&<0.05，b:P&<0.01；与缺血再灌注组相比，c:P&<0.05，d:P&<0.01表2 各组血清、肾脏NO和NOS的测定结果与假手术组相比，a:P&<0.05， b:P&<0.01；与缺血再灌注组相比，c:P&<0.05， d:P&<0.01

　　2.3 肾组织中L选择素的表达

　　免疫组化可见：假手术组中L选择素表达水平最低，而缺血再灌注组表达水平最高，且L选择素既分布于肾小管管壁，又存在于管周结缔组织；缺血预处理组L选择素的表达水平则介于两者之间，多见于管周结缔组织内（图1）。从图2可见， 缺血再灌注组L选择素表达明显高于假手术组（P&<0.01），缺血预处理组L选择素表达介于缺血再灌注组和假手术组之间，且与缺血再灌注组比较具有统计学意义（P&<0.05）。

3 讨 论

　　20世纪80年代Murry等学者首次在犬心实验中发现缺血预处理现象，缺血预处理存在于许多器官，而且不同器官之间有远位保护作用［1］。缺血预处理的机制目前尚未完全清楚，存在一些假说，如腺苷学说、NO学说、ATP敏感性钾通道学说、蛋白激酶C学说、细胞内Ca2+超载、自由基损伤、白细胞黏附和过度活化等［2］。缺血预处理能够明显抑制缺血再灌注组织血管内中性粒细胞的滚动、黏附、迁移和浸润，从而改善微循环达到器官保护的作用［3］。中性粒细胞通过释放氧自由基、蛋白溶解酶、炎症介质等参与缺血再灌注损伤的病理过程，在再灌注早期即出现细胞因子和黏附分子的表达现象［4］。L选择素主要表达于白细胞表面，当白细胞活化后通过蛋白水解方式释放，介导白细胞在血管壁上缓慢地滚动，并与血管内皮细胞黏附，进而启动一系列反应，最终导致白细胞离开循环血液进入组织。本实验中假手术组L选择素表达低，而缺血再灌注组L选择素高表达于管周结缔组织中，在肾小管管壁上也有表达；缺血预处理组L选择素的表达水平介于前两者之间，多表达于管周结缔组织。以上结果表明L选择素在白细胞介导的肾缺血再灌注损伤中发挥着重要作用，而缺血预处理则通过抑制L选择素的表达，减少白细胞对缺血区的肾实质的入侵，从而实现其减轻缺血再灌注损伤的作用。缺血再灌注组肾小管区亦高表达L选择素，可能是大量高表达L选择素的白细胞浸润至实质所致，具体的原因有待进一步探讨。

　　缺血再灌注的过程中，肾组织产生过多的氧自由基或氧自由基的清除能力降低，造成氧自由基的蓄积。氧自由基的蓄积使得生物膜上的脂质过氧化，最终产生丙二醛（MDA），MDA具有细胞毒作用，进而加剧缺血再灌注损伤［5］，而超氧化酶SOD是体内最重要的过氧化酶之一，能够及时地清除过多的氧自由基［6］。本研究结果显示MDA在缺血再灌注组中明显升高，且与假手术组比较具有统计学意义，SOD水平在缺血再灌注组中则显著降低，且与假手术组比较具有统计学意义；而缺血预处理组SOD，MDA都介于假手术组和缺血再灌注组两者之间，说明缺血预处理可以减轻缺血再灌注所造成的脂质过氧化。

　　NO是一种新型的信息分子和传递分子，具有广泛的生物活性。在心脏的缺血预处理中发现内源性NO释放可能与NOS表达增加有关［7］。生理状况下的NO可以调节肾血流和肾小管的重吸收功能，抑制系膜细胞和基质细胞增生，维持肾脏的正常结构和功能；当NO浓度降低时则将引起肾血流量下降，肾小球滤过率降低，从而引起肾结构和功能的损害。本实验结果发现，当肾发生缺血再灌注损伤时，不但血液中NOS、NO水平明显降低，同样肾组织局部的NOS和NO水平明显降低，而经过缺血预处理后，无论血液中还是肾组织局部的NOS，NO水平均得到明显提高从而减轻缺血再灌注损伤，血液中的NOS，NO水平的提高可能与远位器官的缺血预处理保护作用有关［8］。

　　综上所述，缺血预处理对肾缺血再灌注损伤的保护机制可能是：缺血预处理导致NOS表达上调，NO合成增加，NO抑制了黏附分子的表达，从而抑制了中性粒细胞所致的缺血区炎症反应，减轻了缺血再灌注损伤，然而缺血预处理抗黏附作用的终末效应物质还有待进一步研究。

参考文献

［1］ de Zeeuw S， Lameris TW， Duncker DJ， et al. Cardioprotection in pigs by exogenous norepinephrine but not by cerebral ischemicainduced release of endogenous norepinephrine［J］. Stroke， 2001，32（3）:767-774.

［2］ Kosieradzki M. Mechanisms of ischemic preconditioning and its application in transplantation［J］. Ann Transplant， 2002，7（2）:12-20.

［3］ David E， Sawaya JR， Mark B， et al. The role of ischemic preconditioning in the recruitment of rolling and adherent leukocytes in hepatic venules after ischemia/reperfusion［J］. J Surg Research， 1999，85(1):163-170.

［4］ Thomas JD. The role of inflammation after acute stroke: utility of pursuing antiadhesion molecule therapy［J］. Neurology， 1998， 51(3 supple 1): S62-S68.

［5］ Pirat A， Zeyneloglu P， Aldemir D， et al. Pretreatment with simvastatin reduces lung injury related to intestinal ischemiareperfusion in rats［J］. Anesth Analq， 2006， 102(1):252-262.

［6］ Bonder CS， Knight D， HernandezSaaverdra D， et al. Chimeric SOD 2/3 inhibits at the endothelialneutrophil interface to limit vascular dysfunction in ischemiareperfusion［J］. Am J physiol Gastrointest Liver physiol， 2004，287(3): 676-684.

［7］ Zhao T， Xi L， Chelliah J， et al. Inducible nitric oxide synthase mediates delayed myocardial protection induced by activation of adconosine A1 receptors: evidence from geneknockout mice［J］. Circulation， 2000， 102(8): 902-907.

［8］ 贾俊海，陈素仙，张志坚，等.肾脏缺血预处理对心肌缺血再灌注黏附分子表达的影响［J］.江苏大学学报：医学版，2005，15(5)：384-386.