RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响

　　　　 作者：王崇强， 范钰， 徐永中， 庞利群

【摘要】 目的： 研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）对大肠癌肝转移的影响。方法： 根据VEGF基因mRNA设计合成小干扰RNA，采用荧光实时定量PCR检测VEGF mRNA水平，分别以软琼脂集落培养试验和Boyden模型观察癌细胞锚着不依赖性增殖和癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立大肠癌肝转移模型，以不同方法处理的癌细胞接种模型，观察对大肠癌细胞肝转移的影响。结果： 转染组VEGF基因mRNA水平明显降低，且呈浓度和时间依赖性。经VEGF siRNA转染处理的癌细胞软琼脂集落形成数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性（P&<0.05，P&<0.05）。体内试验发现，对照组10只全部出现大肠癌肝转移灶，而siRNA组仅仅1只出现肝转移，差异具有显著统计学意义（P&<0.01）。结论： VEGF基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用；以RNAi技术沉默VEGF基因表达，可抑制大肠癌细胞肝转移。

【关键词】 肠肿瘤；　 肝转移； 血管内皮生长因子； RNA干扰

　　［Abstract］ Objective: To study the effects of vascular endothelial growth factor（VEGF）on liver metastasis of colon cancer. Methods： After human colon cancer cell line LS174T were transfected by VEGF small interfering RNA（siRNA）， the mRNA level was determined by real time RTPCR.The anchorageindependent growth was examined using clone formation in soft agar，and invasion ability was evaluated by boyden chamber model. Thirty nude mice model of colorectal cancer live rmetastasis was established by splenectomy. Results： VEGF siRNA can inhibit anchorageindependent growth and invasion ability in vitro，and reduce liver metastasis of colon cancer in vivo. Conclusion： VEGF siRNA can inhibit liver metastasis of colon cancer.

　　［Key words］ colon carcinoma； liver metastasis；　vascular endothelial growth factor；　 RNA interference

　　肿瘤血管生长是肿瘤生长和转移的基础。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一个强有力的促血管生成因子，在与血管内皮细胞增生相关的生理和病理过程中起重要作用，特别是与实体瘤的关系密切［1］。许多学者发现，VEGF高表达与癌细胞侵袭、转移密切相关［2，3］。大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，被发现时大多数已有转移。有研究报道，大肠癌细胞中VEGF表达增加［4］，且与肝转移具有一定的关系［5］。但国内相关研究较少。
　　
　　本研究借助于小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，采用VEGF基因siRNA转染处理大肠癌细胞LS174T，从体内外观察了对癌细胞侵袭和肝转移的影响。 现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料
　　
　　人大肠癌低分化腺癌细胞株LS174T由中国科学院上海细胞所细胞库从美国ATCC引进并提供，肿瘤细胞常规在含体积分数为10%胎牛血清RPMI1640培养液中培养。针对VEGF siRNA的正义链为：5′GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT 3′。错配siRNA序列（正义链：5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd3′；反义链：5′ACGUGACACGUUCGGAGAATdTdT3′）。均由美国Dharmacon公司合成。Trizol，RNase inhibitor、反转录酶SSRTⅡ，Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。Balb/c裸鼠，30只，雌性，4周龄，体质量约14～18 g，购自中国科学院上海生物化学研究所，于无特殊病原体条件(SPF)下饲养。

　　1.2 细胞培养及转染处理
　　
　　大肠癌LS174T细胞在含10％胎牛血清的RBMI1640培养液，37℃，5％CO2、饱和湿度条件下连续培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1 ml/孔，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。分组：(1)空白对照组(ConA)，即未经任何处理的癌细胞；(2)空载对照组(ConB)，即单一用脂质体处理的对照组；(3)错配对照组(ScrRNA)；(4)siRNA转染组：含10％胎牛血清的RBMI1640中含的已用脂质体包埋的siRNA(3.125，6.25和12.5 nmol/L)。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行以下试验。

　　1.3 实时定量RTPCR检测VEGF mRNA水平
　　
　　收集细胞，以Trizol抽提细胞总RNA，取总RNA 1 μg，以oligo dT（15 mer）为引物反转录合成cDNA第一链，取此cDNA链2 μl为模板进行PCR扩增。以3磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参。扩增步骤及PCR结果分析参照文献［6］进行。VEGF引物序列为：上游：5′GCCTTGCCTTGCTGCTCTAC3′；下游：5′ TTCTGCCCTCCTCCTTCTGC3′。

　　1.4 软琼脂集落形成试验
　　
　　根据文献［7］所述方法，采用软琼脂集落形成试验检测锚着不依赖性增殖情况。于倒置显微镜下随机计数每组样品6个视野中的集落数，取其平均数作比较。

　　1.5 体外侵袭试验
　　
　　根据文献［7］所述方法，以Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数6个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

　　1.6 体内大肠癌肝转移试验

　　1.6.1 细胞分组及处理 细胞分3组：空白对照组，即未经任何处理的癌细胞；空载对照组，即单一用脂质体处理的对照组；siRNA转染组，含10％胎牛血清的RBMI1640中含的已用脂质体包埋的siRNA(12.5 nmol/L)。按照上述方法转染处理，48 h后，用含0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化，机械吹打成细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加适量生理盐水调整细胞浓度至1×107个/ml，以台盼蓝染色测定活细胞率≥95%。

　　1.6.2 肝转移模型 裸鼠平均分为3组，每组10只。采用脾切除法建立大肠癌肝转移模型。整个手术过程遵循无菌操作原则。用1%戊巴比妥钠(35 mg/kg体质量)腹腔内注射麻醉，3～5 min翻正反射消失、麻醉成功后，用胶布固定在手术台上，用安尔碘消毒皮肤手术野；行左上腹纵形小切口，长约1 cm，进腹后显露并小心切断胃脾韧带和胃短血管，完全游离脾脏，小心将其搬出腹腔外；用4号针头于脾脏上极进针，深度约1.5 cm，边退边缓慢(约1～2 min)注入细胞悬液0.1 ml，轻轻按揉至少5 min，使肿瘤细胞进入脾静脉和门静脉，造成血路播散；结扎脾蒂，切除脾脏后，腹壁全层连续缝合关腹。术后继续在SPF条件下饲养。28天后处死裸鼠，计数肝脏表面可见的肿瘤，并经病理组织学证实。

　　1.7 统计方法
　　
　　所测得的数据用均数±标准差（±s）表示。采用SPSS 10.0软件，组间比较进行单因素方差分析，裸鼠模型试验采用方差分析法。以P&<0.05表示差别有统计学意义，P&<0.01表示差别有高度统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 siRNA转染对癌细胞VEGF mRNA的影响
　　
　　为下调癌细胞VEGF基因mRNA水平，本研究采用VEGF siRNA转染大肠癌LS174T细胞。结果发现，与对照组比较，在24，48和72 h VEGF mRNA水平呈浓度和时间依赖性下调（F=274.963，P&<0.001；F=556.835，P&<0.001；F=111.900，P&<0.001）。见图1。
　　
　　图1 siRNA转染对大肠癌细胞VEGF mRNA水平的影响（略）

　　Fig 1 Effects of siRNA on VEGF mRNA level of colon　cancer cell

　　2.2 软琼脂集落形成试验
　　
　　软琼脂集落形成试验结果显示，大肠癌LS174T细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落，而经siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少(F=97.907，P&<0.01）。见图2。
　　
　　图2 VEGF siRNA转染对大肠癌细胞锚着不依赖性增殖的影响（略）

　　Fig 2 Effects of VEGF siRNA on anchorageindependent　growth of colon cancer cell

　　2.3 VEGF siRNA对大肠癌细胞侵袭的影响
　　 　
　　Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面，其数量反映了细胞侵袭能力的大小。收集VEGF siRNA转染48 h的细胞，采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降(F=103.58，P&<0.01）
　　
　　图3 VEGF siRNA转染对大肠癌细胞侵袭的影响（略）

　　Fig 3 Effects of VEGF siRNA on invasion of　colon cancer cell

　　2.4 裸鼠大肠癌肝转移发生率
　　 　
　　本研究采用脾切除法建立大肠癌肝转移模型。结果发现，28天后，两对照组10只(100%)裸鼠肝脏表面均出现肉眼可见的肝转移灶（图4），而siRNA组仅仅1只(10%)出现大肠癌肝转移灶。经方差分析，F=356.338，P&<0.0001，差异有高度统计学意义。
　　
　　图4 肝转移灶（略）

　　Fig 4 Liver metastasis

　　3 讨论
　　
　　在基因研究领域中，RNAi和siRNA引起了广泛的注意。RNAi是近年来发现的一种调节mRNA的生物学现象，能够使基因的mRNA被相应的双链RNA分子剔除，其效果要远强于正义和反义RNA［8］。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。而siRNA是指RNAi过程中在细胞内产生的长约21～25核苷酸(nt)的小双链RNA分子，是RNAi作用机制的重要中间效应分子。而且已有人工合成的siRNA，具有明显的剔除相应基因mRNA的效果［7］。由于siRNA具有高效剔除基因表达的工具，因此它已成为广大科学工作者用来研究基因功能和基因治疗的工具。
　　
　　VEGF家族成员包括VEGFA(即通常所指的VEGF)，VEGFB，VEGFC，VEGFD，VEGFE和胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)。VEGF mRNA经不同的剪切方式可得到7种不同的同工型，其氨基酸残基数分别为121，145，148，165，183，189，206，体内最常见的是VEGF165，VEGF206较少见，并且只在胎肝中有发现。近年研究证明，VEGF在组织器官的发生、正常状态的维持、多种肿瘤的发生、发展以及转移中都发挥着重要作用［9-11］。
　　
　　本研究根据VEGF基因mRNA特点，设计合成siRNA，转染大肠癌细胞，发现VEGF mRNA水平明显下调，且呈浓度依赖性。提示该siRNA可作为研究VEGF的有力工具。
　　
　　肿瘤细胞可以锚着不依赖性生长。肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少可反映肿瘤细胞锚着依赖性的特性，且与其恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多［7］。本研究发现，经不同浓度的VEGF siRNA处理后的大肠癌细胞软琼脂集落数明显减少，且呈剂量依赖性。
　　
　　Boyden小室模型为模拟的人体生理环境，已成为探讨癌细胞侵袭能力的经典模型［7，12］。我们发现，经siRNA处理后的大肠癌细胞穿膜细胞数减少，且呈浓度依赖性。说明，VEGF siRNA可一定程度上抑制大肠癌细胞的侵袭能力。
　　
　　大肠癌细胞侵犯局部输出小静脉后，癌细胞经门静脉系回流入肝，被肝窦、肝窦的内皮细胞和Kupffer细胞捕获、驻留，在肝脏内形成转移灶。本研究采用的脾脏切除法建立大肠癌肝转移动物模型。许多研究发现，该方法所形成肝转移瘤的同时而无并发的脾脏肿瘤，这一点与临床疾病实际过程基本一致，从而能更好地模拟大肠癌切除术后癌细胞回流入门静脉至肝脏血行播散而发生肝转移的过程。本研究进一步采用经VEGF siRNA转染处理的大肠癌细胞接种裸鼠模型，结果发现，对照组10只裸鼠均出现肝转移，而siRNA组仅仅1例出现肝转移，差异有统计学意义。提示，VEGF siRNA转染处理大肠癌细胞，可明显抑制癌细胞肝转移能力。
　　
　　本研究说明，VEGF基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用；以RNAi技术沉默VEGF表达，可明显抑制大肠癌细胞肝转移。其内在机制值得进一步深入研究。

参考文献

　　［1］ Maehara Y， Kakeji Y， Oda S， et al. Tumor growth patterns and biological characteristics of early gastric carcinoma［J］. Oncology，2001，61(2):102-112.

　　［2］ Partanen TA， Paavonen K. Lymphatic versus blood vascular endothelial growth factors and receptors in humans［J］. Microsc Res Tech，2001，55(2):108-121.

　　［3］ Takeda A， Stoeltzing O， Ahmad SA，et al. Role of angiogenesis in the development and growth of liver metastasis［J］. Ann Surg Oncol，2002，9(7):610-616.

　　［4］ Arii S， Ishigami S， Mori A， et al. Implication of VEGF and MMPs in hepatic metastasis of human colon cancer［J］. Nippon Geka Gakkai Zasshi，1998，99(7):436-440.

　　［5］ Stoeltzing O， Liu W， Reinmuth N，et al. Angiogenesis and antiangiogenic therapy of colon cancer liver metastasis［J］. Ann Surg Oncol，2003，10(7):722-733.

　　［6］ 范 钰，郑 树，丁佳逸. 脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制大肠癌细胞端粒酶活性［J］. 中国病理生理杂志，2006，22（4）:761-765.

　　［7］ 范 钰，张尤历，张宇川，等. siRNA剔除STAT3基因对大肠癌LS174T细胞侵袭的抑制［J］. 江苏大学学报：医学版，2007，17（1）：46-48.

　　［8］ Elbashir SM， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］. Nature，2001，411(6836): 494-498.

　　［9］ Favier J，Plouin PF，Corvol P，et al. Angiogenesis and vascular architecture in pheochromocytomas:distinctive traits in malignant tumors［J］. Am J Pathol，2002，161(4):1235-1246.

　　［10］ McCabe CJ，Boelaert K，Tannahill LA，et al. Vascular endothelial growth factor，its receptor KDR/F1K1，and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumors［J］. J Clin Endocrinol Metab，2002，87(9):4238-4244.

　　［11］ Schoppmann SF，Birner P，Stockl J，et al. Tumorassociated macrophages express lymphatic endothelial growth factors and are related to peritumoral lymphan giogenesis［J］. Am J Pathol，2002，161(3):947-956.

　　［12］ 范 钰，张尤历，张 炜，等. RNAi沉默促肝细胞再生磷酸酶3基因抑制肝癌细胞侵袭［J］. 中华肝脏病杂志，2008，16（3）：227-229.