真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165构建及其在COS7细胞中的表达

　　　　作者：陈君 王胜军 仝佳 王海生 马斌 唐莉 胡正军 鲍俊峰 史烨 许化溪

【摘要】 目的： 构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165，并检测其在真核细胞内的表达。方法： 将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay，经酶切鉴定及测序分析，脂质体介导法转染COS7细胞，通过蛋白质印迹法检测其在COS7细胞内的表达水平。 结果： 所构建的真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165转染COS7细胞后，在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论： 成功表达pDisplayhGITRaa1-165蛋白，为GITR的生物学功能研究奠定了基础。

【关键词】 GITR； COS7细胞; 真核表达

　　［Abstract］ Objective: To construct extracellular region of human GITR eukaryotic expression vector pDisplayhGITRaa1-165 and express hGITRaa1-165 protein in COS7 cells. Methods： The hGITRaa1-165 gene fragment containing a signal peptide was cloned into eukaryotic expression vector pDisplay. The constructed recombinant plasmid pDisplayhGITRaa1-165 was identified by restriction analysis and sequencing then transfected COS7 cells in the mediation of liposome. The recombination protein was analyzed by Western blot. Results： A eukaryotic expression vector pDisplayhGITRaa1-165 was successfully constructed. Western blot analysis proved the expression of hGITRaa1-165 in the supernatant of COS7 cells transfected with the recombinant plasmid. Conclusion： The pDisplayhGITRaa1-165 protein was successfully expressed in COS7 cells， providing research foundation for biology of GITR.

　　［Key words］ glucocorticoidinduced tumor necrosis factor; COS7 cells; eukaryotic expression

　　糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor，GITR）是1997年Nocentini等［1］在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体，具有肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）的特征，后被命名为TNFRSF18，属于I型跨膜蛋白。GITR在固有免疫和获得性免疫系统中均发挥重要作用，组成性表达于调节性T细胞表面，在静息期T细胞低表达，受到刺激后表达增加［2，3］。GITR的信号通路可增强抗肿瘤及抗病毒感染作用。GITR能触发效应性T细胞及调节性T细胞的活化［4-7］，调节性T细胞在免疫相关性疾病、肿瘤免疫和抗感染免疫等方面具有重要意义，目前有证据表明GITR与CD4+CD25+Treg 细胞的抑制功能有关。本实验构建pDisplayhGITRaa1-165的真核表达质粒，并在COS7细胞中表达目的蛋白，为进一步研究人GITR生物学作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料
　　
　　DMEM培养基购自美国Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，PCR纯化试剂盒、DNA Ligase、高GC 缓冲液Ⅰ，Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶、DL2000分子质量标准参照物均购自Takara Biotec公司，琼脂糖为上海意图公司分装产品， 梭华SofastTM脂质体购自厦门太阳马生物工程有限公司，ECL发光底物购自GE公司，蛋白相对分子质量标准参照物购自Fermentas公司，HRP羊抗小鼠IgG购自美国KPL公司，pGEMThGITR、小鼠抗人GITR多克隆抗体、E.coli DH5α，COS7细胞株由本室保存。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 hGITRaa1-165基因的扩增 根据基因库中人GITR基因（序列号为AY358877）胞外段序列（hGITR aa1-165）以及pDisplay多克隆位点，通过Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。正链引物5′端加Bgl II酶切位点，序列为: 5′CTTAGATCTATGGCACAGCACGGGGCG3′，反链引物5′端加PstI酶切位点，序列为： 5′TATCTGCAGACCACCCAAGCGGCTCTG3′。以pGEMTGITR质粒［8］为模板，进行PCR反应，扩增条件：94℃ 5 min预变性，94℃ 变性30 s，63℃ 复性30 s，72℃延伸30 s，共28个循环。PCR产物在琼脂糖(10 g/L)凝胶上进行电泳，Genius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定。

　　1.2.2 hGITRaa1-165基因表达载体的构建与鉴定 将pDisplay载体和目的基因的PCR回收纯化产物进行BglⅡ， PstⅠ双酶切，37℃过夜。酶切产物在琼脂糖凝胶(10 g/L)上进行电泳，切胶回收。回收纯化后目的基因GITRaa1-165和载体质粒pDisplay，按7∶1的摩尔浓度比例，用T4DNA连接酶进行黏性末端定向连接，16℃过夜。次日将连接产物用热休克法转化感受态E.coli DH5α菌，涂板，挑取单个菌落至3 ml LB培养基（含50 μg/ml 氨苄西林）中，37℃增菌过夜。提取重组质粒DNA进行质粒PCR及酶切鉴定，阳性质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

　　1.2.3 转染COS7细胞 以含10%小牛血清的培养基培养COS7细胞，置37℃恒温，5%CO2孵育培养。转染前24 h，以胰酶消化细胞，按细胞3.0×105/孔接种于6孔板中，于细胞70%～80%汇合度时，分别将 2 μg DNA 质粒及 8 μl 梭华SofastTM稀释于 100 μl 不含血清和抗生素的DMEM 中，轻轻混匀。将 100 μl梭华SofastTM 稀释液滴加到 100 μl DNA 稀释液中，一边滴加一边混匀，室温孵育 15～20 min，200 μl 梭华SofastTM/DNA 复合物加到孔中并轻轻摇动使均匀混合，放置 37℃，5%CO2 孵育箱孵育24 h，48 h，72 h。

　　1.2.4 瞬时表达的检测 取上述细胞上清液20 μl行SDSPAGE电泳，以明确目的蛋白在细胞中的表达。用SDSPAGE胶分离蛋白后，将分离胶中的蛋白经电转印至PVDF膜上（恒流350 mA，4℃，2 h），用TBS/T配制的5%脱脂牛奶封闭电转后PVDF膜1 h，一抗为1∶1 000稀释的小鼠抗人GITR的多克隆抗体，二抗为1∶5 000稀释的HRP羊抗小鼠IgG抗体，最后加ECL发光底物，室温孵育2 min后，曝光洗片观察结果。

　　2 结果

　　2.1 hGITRaa1-165基因扩增结果
　　
　　以pGEMTGITR质粒为模板，扩增GITR胞外段序列，结果条带为495 bp，与预期片段大小相符（图1）。
　　
　　1：DNA标准参照物DL2000； 2：hGITRaa1-165基因

　　图1 hGITRaa1-165基因的PCR结果（略）

　　Fig 1 Product of hGITR aa1165 amplified by PCR

　　2.2 hGITRaa1-165基因表达载体的鉴定
　　
　　将hGITRaa1-165亚克隆到真核表达载体pDisplay多克隆位点中，重组克隆经酶切及PCR鉴定，目的片段大小与预期相符（图2）。测序结果显示目标序列与基因库（序列号为AY358877）相应序列完全相符（结果未显示），证实表达载体构建成功，命名为pDisplayhGITRaa1-165。

　　2.3 目的蛋白在COS7细胞中的表达
　　
　　转染pDisplayhGITRaa1-165质粒的COS7细胞培养上清液， 经蛋白质印迹法检测呈现阳性条带，确定最佳收集蛋白时间为24 h。结果见图３。

　　1:DNA 标准参照物DL2000； 2:pDisplayhGITRaa1-165质粒； 3:pDisplayhGITRaa1-165质粒BglⅡI和PstⅠ双酶切

　　图2 pDisplayhGITRaa1-165真核表达载体的鉴定（略）

　　Fig 2 Identification of eukaryotic expression　plasmid pDisplayhGITRaa1-165

　　1:蛋白标准参照物； 2:pDisplay质粒(阴性对照)； 3:pDisplayhGITRaa1-165质粒　

　　图3 hGITRaa1-165在COS7细胞中的表达（略）

　　Fig 3 Expression of hGITRaa1-165 fusion protein　in COS7 cells

　　3 讨论
　　
　　GITR在人类和小鼠Treg细胞上具有高水平表达，因而被认为是Treg细胞的一种分子标记［5］。CD4+CD25+Treg 细胞主要功能是抑制自身反应性T细胞，其作用是通过直接的TregT 效应细胞之间的相互接触方式来实现的。在鼠体外效应性CD4+ CD25-T细胞和抑制性CD4+CD25+T细胞的共培养体系中加入抗GITR抗体，可完全消除Treg细胞的抑制作用［5］。尽管GITR在人Treg细胞上也是高表达，但有报道显示抗人GITR或者是GITRL重组蛋白并不能干预Treg细胞的抑制活性［9］，提示GITR作用存在物种间差异，因而GITR对人细胞亚群的功能还需要进一步研究。在这个领域的深入研究有望通过应用抗体或GITR融合性蛋白阻断GITR激活来治疗免疫相关性疾病或肿瘤。因此，我们通过构建真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165并在COS7细胞中的有效表达，为研究GITR胞外段的生物学作用及其分子机制奠定了基础，还将会为自身免疫性疾病和肿瘤等的治疗提供新的方法和途径。
　　
　　在本研究中，我们使用的真核表达质粒pDisplay可将表达的融合蛋白锚定在细胞膜的表面，但我们去除了质粒pDisplay中起锚定作用的基因片段PDGFRTM，而GITR胞外段基因片段带有信号肽，因此表达出的蛋白能分泌到细胞培养液上清中。人类GITR位于1号染色体［10］，胞外区由139个氨基酸组成，此外有26个氨基酸形成人GITR 信号肽部分。我们的GITR胞外段基因为495 bp，扣除信号肽后分泌的蛋白约为15.6 kD，用蛋白质印迹检测表明，蛋白的相对分子质量同预期的结果相一致。从图3可见蛋白的表达量较低，因此，还需进一步优化转染条件。为得到该蛋白持续稳定的表达，建立蛋白稳定表达细胞株的相关研究正在进行中。
　　
　　

参考文献

　　［1］ Nocentini G， Giunchi L， Ronchetti S，et al. A new member of the tumor necrosis factor / nerve growth factor receptor family inhibits T cell receptor induced apoptosis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1997， 94(12): 6216-6221.

　　［2］ Hanabuchi S， Watanabe N， Wang YH， et al. Human plasmacytoid predendritic cells activate NK cells through glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptorligand(GITRL)［J］. Blood，2006， 107（9）: 3617-3623.

　　［3］ Nocentini G， Riccardi C.GITR: A multifaceted regulator of immunity belonging to the tumor necrosis factor receptor superfamily［J］. Eur J Immunol， 2005， 35(4): 1016-1022.

　　［4］ McHugh RS， Whitters MJ， Piccirillo CA， et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: Gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoidinduced TNF receptor［J］. Immunity，2002， 16(2): 311-323.

　　［5］ Shimizu J， Yamazaki S， Takahashi T， et al.Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological selftolerance［J］. Nat Immunol， 2002， 3(2): 135-142.

　　［6］ Ronchetti S， Zollo O， Bruscoli S， et al. GITR， a member of the TNF receptor superfamily， is costimulatory to mouse T lymphocyte subpopulations［J］. Eur J Immunol， 2004，34(3): 613-622.

　　［7］ Tone M， Tone Y， Adams E， et al.Mouse glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor ligand is costimulatory for T cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100(25): 15059-15064.

　　［8］ 仝 佳，王胜军，毛朝明，等.人GITR基因的克隆和序列分析［J］. 江苏大学学报：医学版，2007，17(1)：15-18.

　　［9］ Leving MK， Sangregorio R， Sartirana C， et al. Human CD25+CD4+T suppressor cell clone produce transforming growth factor β，but not interleukin 10，and are distinct from type 1 T regulatory cells［J］. J Exp Med， 2002，196(10):1335-1346.

　　［10］ Verdeil G， PuthierD， Nguyen C， et al. STAT5mediated　signals sustain a TCRInitiated gene expression program　toward differentiation of CD8 T cell effectors［J］. J Immunol， 2006， 176(8) : 4834 - 4842.