皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGFβ1mRNA表达及意义

【摘要】 目的： 检测活动期皮肌炎(dermatomyositis，DM)患者外周血CD4+T细胞中转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）以及血清磷酸肌酸激酶（CK）含量。初步探讨CD4+T细胞TGFβ1在皮肌炎发病机制中的作用。方法： 收集12例活动期皮肌炎患者和12例健康对照者外周血，采用免疫磁珠分离法获得CD4+T细胞，通过RTPCR方法检测出各组TGFβ1表达水平。观察CD4+T细胞中TGFβ1表达与CK含量的相关性。结果： 活动期皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGFβ1相对表达量为0.751±0.107，显著高于健康对照0.438±0.170﹙P&<0.05﹚。CD4+T细胞TGFβ1表达量与CK含量呈中度正相关﹙r=0.67， P&<0.05﹚。结论： 活动性皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGFβ1 mRNA表达显著升高，可能与皮肌炎疾病发生有关。

【关键词】 皮肌炎 CD4 T细胞 β1

　　［Abstract］ Objective: To investigate the expression of transforming growth factorβ1 (TGFβ1)mRNA in CD4+ T cells of peripheral blood from the dermatomyositis (DM)patients in active stage， and explore the association with serum creatinkinase levels. Methods： CD4+T cells from peripheral blood were isolated by microbeads，and TGFβ1 mRNA was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). Results： The expression of TGFβ1 was significantly higher in CD4+ T cells from the dermatomyositis patients than those from healthy control group (0.751±0.107 vs 0.438±0.170，P&<0.05﹚. There was positive correlation between the expression levels of TGFβ1 mRNA and serum creatinkinase levels（r=0.67，P&<0.05﹚. Conclusion： TGFβ1 was significantly higher in CD4+ T cells of peripheral blood from the dermatomyositis patients. TGFβ1 may play a role in the damage of DM.

　　［Key words］ dermatomyositis；CD4+ T cells；TGFβ1

　　皮肌炎(dermatomyositis，DM)是一组亚急性或慢性起病、免疫介导的自身免疫性疾病， 主要表现为对称性的肢体近端无力、肌肉疼痛、肌酶明显升高，同时伴有以眶周为中心的紫红色水肿性斑、Gottron氏征等特征性皮肤损害。组织病理学特点为肌组织内炎细胞浸润与肌纤维坏死［1］。其病因及发病机制目前尚不完全清楚， 但近年来在皮肌炎患者受累皮肤和肌肉活检中发现大量活化的CD4+T细胞浸润，CD4+/CD8+比值为2.5［2］。转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）是人体多种组织细胞的生长调控因子，对细胞外间质表达、基质降解、细胞增殖分化和细胞凋亡功能等有明确的作用。并且，TGFβ1还具有较强的免疫调节作用。本研究通过检测皮肌炎患者外周血CD4+T细胞TGFβ1 mRNA的表达，同时与患者血清CK含量进行相关性分析，探讨其在皮肌炎发病机制中的作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象　

　　12例活动期皮肌炎患者选自2007年6月～2008年2月江苏大学附属医院风湿科、皮肤科门诊及住院患者，其中男5例，女7例，年龄40～65岁，平均51.6岁。病程2个月～3年，平均2.15年。诊断依据为1975年Bohan的诊断标准［3］，剔除合并肿瘤及重叠综合征患者。以临床表现、补体降低、肌酶、血沉升高以及肌电图改变综合判断疾病的活动性。检测前，患者至少3个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调节作用的药物治疗。选用单位体检正常者为健康对照组，其中男5例，女7例，年龄41～66岁，平均51.2岁。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　Trizol试剂(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Toyobo公司)；水平电泳槽(BioRad公司)；凝胶电泳图像分析仪(Syngene公司)；免疫磁珠(Miltenyi公司)。

　　1.3 细胞分离

　　收集患者和健康对照者静脉血10 ml，肝素抗凝，通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，再采用免疫磁珠分离出CD4+T细胞，细胞纯度大于92%。

　　1.4 RTPCR

　　按常规方法提取总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA后-20℃贮存备用。根据基因库中公布的基因序列，通过Primer Premier 5.0 软件设计PCR特异性引物，聚合酶链反应引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列为：βactin上游引物5′CACGAAACTACCTTCAACTCC3′，下游引物5′CATACTCCTGCTTGCTGATC3′，扩增产物262 bp；TGFβ1上游引物5′GCTCCTGTGACAGCAGGGAT3′，下游引物5′ GGCAGAAGTTGGCATGGTAG3′，扩增产物303 bp。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃（βactin）或54℃（ TGFβ1 ）退火，72℃ 45 s，共30个循环，72℃延伸7 min。

　　1.5 PCR产物分析及半定量计算

　　PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，计算CD4+T细胞TGFβ1和βactin条带密度比值（TGFβ1/βactin）作为TGFβ1的相对表达强度。

　　1.6 统计学分析

　　所有数据采用SPSS11.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P&<0.05 为差异有统计学意义。两变量的相关程度采用直线相关分析法。

　　2 结 果

　　2.1 活动性皮肌炎患者CD4+T细胞TGFβ1 mRNA表达水平检测结果

　　健康对照（n=12）和皮肌炎患者（n=12）CD4+T细胞TGFβ1的相对表达强度分别为0.438±0.170和0.751±0.107，经检验t=5.38，P&<0.01。见图1。

　　2.2 活动期皮肌炎患者CD4+T细胞TGFβ1 mRNA表达水平与血清CK含量相关性分析

　　活动期皮肌炎患者CD4+T细胞与血清CK含量的相关系数为r=0.67，P&<0.05，呈中度正相关。见图2。

　　3 讨 论

　　研究认为皮肌炎是由于日光辐射、微生物感染、外伤等诱因致使易感人群发生自身免疫紊乱并导致皮肤、横纹肌为主等器官损伤的一种结缔组织疾病。皮肌炎患者肌内膜及其血管周围存在大量以活化的CD4+T淋巴细胞为主，部分B细胞以及巨噬细胞参与的单个核细胞群的浸润［4］。近来研究发现皮损组织中Th淋巴细胞介导的炎症，微血管损害和角质形成细胞的凋亡失调是疾病发生的重要机制。

　　TGFβ1是一类具有双向调节功能的生长因子，主要由活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞合成和分泌，某些肿瘤细胞、成骨细胞以及内皮细胞也可产生，TGFβ1能趋化巨噬细胞和成纤维细胞，促进血管生成，从而在创伤修复中起重要作用。TGFβ1也具有促进和抑制免疫的双向调节功能。根据不同的表达量发挥不同的效应。对TGFβ1基因敲除小鼠的研究发现［5］，肌肉组织中TGFβ1在正常表达情况下具有抗炎作用。然而当TGFβ1过度表达时，促进炎症发生并可导致肌内膜纤维化。此作用可能与TGFβ1刺激自身肌肉组织结缔组织生长因子的表达有关。CTGF能促进成纤维细胞增殖迁移， 细胞外基质形成［6］。在Duchenne 肌营养不良病中发现肌组织中TGFβ1 mRNA表达明显增高。Amemiya等［7］对5例皮肌炎患者采用大剂量静脉滴注免疫球蛋白治疗，对治疗前后患者肌活检比较后发现，临床症状和组织学改善的同时TGFβ1表达也显著下降。

　　本次实验结果显示，皮肌炎患者CD4+T细胞TGFβ1表达明显高于健康对照组。皮肌炎患者血清CK均值为（2503.42±1344.05）U/L，较正常值（0～200 U/L）显著增高，与TGFβ1表达呈中度正相关。提示TGFβ1可能是导致皮肌炎肌肉损害的原因之一。患者中有5例伴有肺间质病变，肺纤维化，1例伴甲状腺瘤，1例伴甲状腺功能减退；5例肺间质病变、肺纤维化患者TGFβ1表达尤为增高，均高于0.80；可能与TGFβ1具促进成纤维细胞增殖致纤维化有关。此外，TGFβ1还对早期肿瘤有抑制作用，进展期促进肿瘤浸润、转移［8］。皮肌炎患者特别是部分老年患者常伴随肿瘤的发生。本次实验中并未发现伴有肿瘤的患者，可能与所选病例病程较短以及样本数量少、患者以中年为主有关。要进一步了解TGFβ1在皮肌炎发病机制中的作用还需要增加病例作进一步研究。

参考文献

［1］ 史玉泉， 周孝达， 吕传真. 实用神经病学［M］.3 版.上海: 上海科学技术出版社， 2004：1271-1273.

［2］ Caproni M， Torchia D，Cardinali C，et al.Infiltrating cells，related cytokines and chemokine receptors in lesional skin of patients with dermatomyositis［J］. Br J Dermatol，2004，151(4):784-791.

［3］ Smits HH， de Jong EC， Schuitemaker JH， et al. Intercellular adhesion molecule1/LFA1 ligation favors human Th1 development ［J］. J Immunol，2002 ，168(4):1710-1716.

［4］ Grundtman C， Malmstrom V， Lundberg IE. Immune mechanisms in the pathogenesis of idiopathic inflammatory myopathies［J］. Arthritis Res Ther，2007，9(2): 208.

［5］ Amemiya K，SeminoMora C，Granger R，et al.Development of inflammatory myopathy in TGFβ1 knockout mice: Characterization of the disease and attenuation after treatment with fibronectin peptides［J］. Neurology，1999，52(S2)：A448.

［6］ Maeda N， Kanda F， Okuda S， et al. Transforming growth factorbeta enhances connective tissue growth factorexpression in L6 rat skeletal myotubes［J］. Neuromuscul Disord，2005，15(11)：790-793.

［7］ Amemiya K， SeminoMora C， Granger RP， et al.Downregulation of TGFbeta1 mRNA and protein in the muscles of patients with inflammatory myopathies after treatment with highdose intravenous inmmunoglobulin［J］.Clin Immunol ，2000 ，94(2):99-104.

［8］ 俞清翔.转化生长因子β与肿瘤转移的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2006，14（25）:2538-2541.