中心体有关激酶Aurora A和mt P53在大肠癌中的表达及意义

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【摘要】 　　目的： 研究中心体相关激酶AuroraA和突变型P53(mtP53)在大肠癌中的表达规律，探讨其相互关系及在肿瘤发生发展中的作用. 方法： 应用组织芯片和免疫组化技术（SP法）检测AuroraA和mtP53在51例大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中的表达，并结合临床病理学参数进行综合分析. 结果： 在正常大肠组织、癌旁组织和大肠癌组织中AuroraA的阳性表达率分别为0，36％和69％；mtP53的阳性表达率分别为0，21％和57％. 与正常大肠组织和癌旁组织相比，大肠癌组织中AuroraA和mtP53的表达明显升高（P&<0.05）；两者的表达与肿瘤的浸润程度关系密切（P&<0.05），mtP53还与Dukes分期和淋巴结转移有关（P&<0.01）. AuroraA在大肠癌组织中的表达与mtP53表达呈显著正相关（r= 0.776， P&<0.01）. 结论： AuroraA蛋白的过表达与P53的突变在大肠癌的发生、发展中发挥着重要作用. AuroraA和mtP53蛋白的表达对大肠癌的早期诊断及预后判断具有重要价值.
【关键词】 AuroraA；基因，P53；基因组不稳；组织芯片；结直肠肿瘤
　　【Abstract】AIM: To investigate the expression levels of centrosomeassociated kinase AuroraA and mutant type P53(mtP53) in colorectal cancer and to explore their mutual relationship and their roles in tumorigenesis and tumor progression. METHODS: Pathological specimens from colorectal cancer， pericancerous tissues and normal colorectal tissues were examined for the expression levels of AuroraA and mtP53 proteins by tissue microarray technique and immunohistochemistry (SP method)， and the clinicopathological parameters were analyzed. RESULTS: The positive rates of AuroraA expression in normal colorectal tissues， pericancerous tissues and colorectal cancer were 0%， 36% and 69% respectively and the positive rates of mtP53 expression in normal colorectal tissues， pericancerous tissues and colorectal cancer were 0%， 21% and 57% respectively. Compared with normal colorectal tissues and pericancerous tissues， the expression levels of AuroraA and mtP53 were significantly higher in tumor tissues (P&<0.05). AuroraA overexpression was related to the depth of invasion and mtP53 overexpression was related to the depth of invasion， lymph node metastasis and Dukes classification (P&<0.05). There was a strong positive correlation between the expressions of AuroraA and mtP53(r=0.776， P&<0.01). CONCLUSION: Overexpression of AuroraA and mutation of P53 play a critical role in tumorigenesis and tumor progression of colorectal cancer. So codetection of AuroraA and mtP53 may be useful for early diagnosis and prognosis prediction of colorectal cancer.
　　【Keywords】 AuroraA; cenes， P53; genomic instability; tissue microarray; colorectal neoplasms
　　0引言
　　有丝分裂过程的偏差会导致基因组不稳定从而引发肿瘤. 研究发现，AuroraA是维持基因组稳定性所必需的、关键的有丝分裂调节因子，这个中心体相关激酶在肿瘤细胞中过度表达［1］. 突变型P53(mtP53)在维持基因组稳定方面同样发挥着重要作用，它参与DNA的复制和修复. 我们利用组织芯片和免疫组化技术检测AuroraA和突变型mtP53蛋白在大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中的表达，旨在探讨它们在大肠癌发生、发展中的作用及相互关系.
　　1对象和方法
　　1.1对象收集甘肃省肿瘤医院2003/2005年和兰州石化医院2001/2005外科手术切除大肠腺癌石蜡包埋标本51（男29，女22）例，年龄26～74(平均59.7)岁. 入选条件：① 病史资料齐全；② 术前未经放疗及化疗患者. 组织学类型：管状腺癌31例，乳头状腺癌13例，黏液腺癌7例. 组织分化：高分化24例，中分化19例，低分化8例. 浸润程度：黏膜及黏膜下层5例，肌层13例，浆膜层33例. 有淋巴结转移12例，无淋巴结转移39例. 另取该组大肠腺癌病例中肿瘤手术切除标本切缘处正常大肠黏膜（病理证实）石蜡包埋标本15例作为对照. 在大肠癌组织蜡块相应部位标记大肠癌旁组织黏膜，在组织芯片制作时取出，共选取14例. 兔抗人AuroraA多克隆抗体（英国AbD seroTec公司）；鼠抗人mtP53 mAb，SP超敏试剂盒，DAB显色试剂盒，PBS缓冲液，柠檬酸盐抗原修复缓冲液，防脱片（福州迈新公司）；石蜡切片机（德国Leica仪器厂）；电热恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂）.
　　1.2方法
　　1.2.1组织芯片设计和制备将大肠腺癌石蜡包埋标本重新切片，HE染色. 由病理专家复查HE切片，在显微镜下分别用标记笔画圈标记出典型癌灶（富有肿瘤细胞且无坏死出血的区域）及癌旁组织黏膜（距肿瘤2 cm的正常组织），然后在组织蜡块上相应的区域标记选取组织点，并参照文献［2］的方法应用组织芯片仪制备组织芯片.
　　1.2.2免疫组织化学染色采用SP法，染色步骤按说明书进行. 抗体AuroraA工作液浓度为1∶100， P53为即用型，二者都需要抗原修复，DAB显色，苏木素复染. 以PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性片作为阳性对照.
　　1.2.3阳性结果判定AuroraA和mtP53阳性染色为黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，AuroraA定位于细胞质，mtP53定位于细胞核. 采用二级计分法，染色强度分类：0分为无色；1分为黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色（深浅与背景色相对比）. 阳性细胞计数：在400倍镜下选定10个视野肉眼显微镜下观察，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计1000个细胞，计算阳性细胞所占百分比. 阳性细胞（％）＝阳性细胞数/所计数细胞总数×100％. 1分为阳性细胞≤10%；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为&>76%. 两者记分相乘后0～3分为阴性；&>3分为阳性［3］.
　　统计学处理： 计数资料采用χ2检验，相关分析采用Spearman等级相关分析. 统计学软件采用SPSS 10.0软件包，P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2结果
　　2.1AuroraA，mtP53在大肠癌组织、癌旁组织、正常大肠组织中的表达构建两张组织芯片分别含42个位点（包括2个标记点，图1）. 其中个别脱落位点用常规切片补充. 在正常大肠组织中，AuroraA低表达，个别腺细胞胞质中出现黄色颗粒并呈散在分布，mtP53无1例表达. 在癌旁组织中，AuroraA和mtP53染色阳性细胞胞质或胞核呈黄色或棕黄色颗粒并散在或片状分布，阳性表达率分别为36％（5/14）和21％（3/14），阳性细胞主要见于异型增生的上皮，成纤维细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞中未见表达. AuroraA和mtP53在大肠癌组织中的表达明显增强，染色强度均强于正常大肠组织和癌旁组织，阳性细胞胞质或胞核出现棕褐色颗粒并呈片状和/或弥漫分布，阳性表达率分别为69％（35/51）和57％（29/51），明显高于癌旁组织（P&<0.05，图2，3）和正常大肠组织（P&<0.01）.
　　所构建的两张组织芯片分别含42个位点，每张右上方第1行的2个点为标记点，病例共80个点，分别代表51例大肠癌组织，15例正常大肠组织和14例癌旁组织.
　　图1组织芯蜡块和组织芯片
　　A：正常大肠组织；　　 B：中分化大肠腺癌组织.
　　图2AuroraA在正常大肠组织和中分化大肠腺癌组织中的表达SP ×400图3mtP53 在低分化大肠腺癌组织中的表达SP ×400
　　2.2AuroraA，mtP53的表达与大肠癌组织临床病理特征的关系AuroraA，mtP53的表达与性别、年龄、组织学分型及病理学分级无关（P&>0.05，表1），但均与浸润程度有关（P&<0.05），mtP53还与淋巴结转移和Dukes分期密切相关（P&<0.01），而AuroraA则与淋巴结转移和Dukes分期无关（P&>0.05）. 表1AuroraA，mtP53蛋白表达与大肠癌组织临床病理特征的关系
　　2.3AuroraA，mtP53在大肠癌组织中表达的关系AuroraA和mtP53蛋白共同表达阳性者29例，共阴性者16例，AuroraA表达阳性而mtP53表达阴性者6例，AuroraA表达阴性而mtP53表达阳性者0例. AuroraA与mtP53表达呈正相关（r=0.776， P&<0.01）.
　　3讨论
　　中心体作为细胞的微管组织中心，当出现扩增等异常现象时可导致错误的纺锤体装配和染色体分离，从而造成基因组不稳定，研究表明几乎所有的肿瘤组织及肿瘤细胞系都存在中心体异常现象［4］. 人类AuroraA属于Aurora家族，是一个和中心体相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，在有丝分裂间期位于中心体，而在有丝分裂前期和后期位于纺锤体，说明它与中心体的分离、成熟以及纺锤体装配都密不可分，当AuroraA过表达时可导致中心体扩增、染色体不稳定和细胞转化. 有研究［1，5］发现，AuroraA基因位于染色体20q13，这个区域在许多恶性肿瘤中都存在基因扩增. 因此，当AuroraA过表达时它可能是一种潜在的癌基因，并通过多种途径参与肿瘤的发生、发展. wtP53蛋白在维持基因组稳定方面同样发挥重要作用，研究［6］发现wtP53下调、缺失或突变都会导致中心体扩增和基因组不稳定. 虽然已有研究［5］证实AuroraA在乳腺癌及胃癌等实体肿瘤中存在过表达，但应用组织芯片技术检测AuroraA和mtP53在大肠癌、癌旁组织和正常大肠组织中的表达，目前国内外还鲜有报道. 我们的结果显示，与大肠癌旁及大肠正常组织相比，AuroraA和mtP53在大肠癌组织中的表达明显增强（P&<0.05），提示AuroraA和mtP53蛋白表达的升高与大肠癌的发生有关.

　　关于AuroraA和mtP53与大肠癌临床病理特征的关系，我们发现AuroraA的表达只与肿瘤的浸润程度有关. 其浸润程度越深，AuroraA的阳性表达率越高，提示AuroraA蛋白表达的升高可能在大肠癌的进展中起一定作用. mtP53在既往研究［7］中被认为与肿瘤的发展有关，我们发现，mtP53蛋白的阳性表达率与肿瘤的浸润程度有关，并且与淋巴结转移和Dukes分期关系密切，说明mtP53也参与了肿瘤的发展，这可能是由于mtP53对大肠癌细胞的调控作用减弱或消失，从而导致癌细胞的浸润和转移. 淋巴结转移是目前公认的大肠癌预后不良的重要指标，因此，共同检测AuroraA和mtP53蛋白的表达水平可有助于大肠癌的早期诊断和预后判断［8-9］.
　　而对于AuroraA和mtP53在大肠癌演变过程中的相互关系，有研究［10］报道wtP53蛋白对AuroraA起负调控作用，在细胞内以转录活化非依赖的方式（transactivationindependent）直接结合在AuroraA的N端并抑制其活性，从而阻止AuroraA过表达所诱导的中心体扩增和细胞转化；另一方面，AuroraA高度活化又可抑制wtP53所介导的负性调节，其重要机制是AuroraA对P53的Ser315磷酸化，从而促进Mdm2介导的P53通过泛素化途径降解，也可对P53的Ser215磷酸化，抑制P53的转录活性，并以同样方式抑制P53下游基因的活性，比如P21CIP/WAF1和PTEN，最终使P53失去正常功能［11-12］. 这些发现都提示AuroraA可能是wtP53通路中的一个重要调节因子，过表达或过度激活AuroraA会打破细胞内的AuroraAP53平衡，造成细胞恶性增殖. 我们采用同一组病例作了两种蛋白表达的检测，结果显示，AuroraA与mtP53在大肠癌中的表达显著正相关（P&<0.01），并且随着肿瘤细胞浸润程度的加深，两者的表达都有所增强，这些都提示AuroraA和mtP53在大肠癌的发生发展过程中存在一定联系，它们可能共同参与了肿瘤的进展. 然而，AuroraA和mtP53也有个别表达不一致，说明AuroraA和mtP53有相关性但又可能都是独立的致瘤因子.
　　我们发现从正常大肠组织、癌旁组织到大肠癌组织，这个进程与AuroraA和mtP53表达的递增密切相关，两者在肿瘤的发生、发展中起着相互促进的作用. 由于AuroraA 与肿瘤的发生有关，因此，AuroraA有可能成为肿瘤治疗的一个靶点.
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