关于常用抗癫痫药对大鼠体内Oatp2表达的影响

论文代写网： 【摘要】 目的： 研究常用抗癫痫药AEDs丙戊酸钠（VPA）、卡马西平（CBZ）、苯妥英钠(PHT)对正常及癫痫大鼠脑、肝内Oatp2表达的影响. 方法： 采用氯化锂匹罗卡品诱发Wistar大鼠慢性自发性癫痫（SE），分别予VPA［187.5 mg/(kg·d)］， CBZ［125 mg/(kg·d)］， PHT［62.5 mg/(kg·d)］治疗4 wk后，采用免疫组化SABC法检测大鼠脑、肝内Oatp2分布，Western Blot及 RTPCR方法检测Oatp2蛋白及mRNA的表达水平. 结果： ① 脑、肝组织中均可见Oatp2免疫反应阳性物质，分别表达于脑微血管内皮细胞、脉络丛上皮细胞及肝细胞；② 与正常对照相比，癫痫大鼠及AEDs治疗大鼠脑内Oatp2蛋白表达均降低，而Oatp2mRNA表达无明显变化；③ 癫痫大鼠肝内Oatp2mRNA与蛋白表达与正常对照组相比无明显变化；而使用CBZ， PHT后大鼠肝内Oatp2mRNA与蛋白表达上调，使用VPA后肝内Oatp2mRNA与蛋白表达下调. 结论： VPA， CBZ， PHT均可下调脑内Oatp2表达，而对肝内Oatp2的表达变化存在不同影响，AEDs可能通过影响Oatp2表达，影响其自身向脑内的转运和在体内的代谢.
【关键词】 有机阴离子转运多肽2 癫痫 自发反复发作
　　 0引言
　　耐药癫痫患者及动物脑内存在P糖蛋白(Pglycoprotein， Pgp)等外排型转运体的高表达，可使癫痫靶组织内抗癫痫药(antiepileptic drugs， AEDs)浓度下降而产生耐药现象［1］. 有机阴离子转运多肽(Organic Anion Transporting Polypeptides， OATPs)是主要对底物起内向转运作用的内流型膜转运体［2］，啮齿动物脑内主要的Oatp亚型Oatp2与Pgp在Wistar鼠脑内的分布具有一致性，且痫性发作可抑制脑内Oatp2的表达，而使Pgp表达增加［3］. 　　除痫性发作外，AEDs也是影响脑内Pgp表达变化的因素［4］. 但AEDs是否也影响Oatp2在脑内的表达和在体内重要代谢器官肝内的表达呢，目前均不清楚. 故我们在正常及氯化锂匹罗卡品诱导的癫痫大鼠模型中，研究常用AEDs（VPA， CBZ， PHT)对脑、肝内Oatp2表达的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料氯化锂、匹罗卡品（Sigma公司）；Oatp2单抗（ADI公司）；免疫组化SABC试剂盒（博士德公司）；PVDF膜（BioRad公司）；RIPA裂解液（碧云天公司）；Prolight HRP化学发光检测试剂（北京TIANGEN公司）；丙戊酸钠（湖南省湘中制药有限公司）；卡马西平（上海三维制药有限公司）；苯妥英钠（湖南省湘中制药有限公司）；小量组织/细胞总 RNA 抽提试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）；AMV逆转录酶、Tag酶（大连宝生物工程有限公司）. 健康、成年Wistar大鼠64只（重庆医科大学实验动物中心提供，体质量160~250 g），雌雄各半，饲养于12 h12 h光暗环境，给予标准饲料及饮水.
　　1.2方法
　　1.2.1大鼠癫痫模型的制备及分组参照本组前期实验采用氯化锂匹罗卡品（lithiumpilocarpine，Sigma公司）诱发癫痫模型［5］. 于大发作后60 min腹腔注射10 g/L水合氯醛溶液(400 mg/kg)中止发作. 选取大发作后存活动物，自造模当日起，每天观察动物自发反复惊厥发作（spontaneous recurrent seizures， SRSs）的发生情况，结果13～26 d后，模型组均出现SRSs，即进入癫痫期. 选取进入癫痫期动物，按使用AEDs的不同分为：丙戊酸钠治疗（SE+VPA）组、卡马西平治疗（SE+CBZ）组、苯妥英钠治疗（SE+PHT）组，并设未治疗的SE对照组，每组8只动物；另选正常大鼠作为同比对照，分为正常对照（NS）组，丙戊酸钠（NS+VPA）组、卡马西平（NS+CBZ）组、苯妥英钠（NS+PHT）组，每组8只动物. 药物处理组分别按187.5， 125， 62.5 mg/kg予VPA，CBZ，PHT灌胃，1次/d. 用药4 wk后，麻醉下快速分离大鼠脑、肝组织，储于液氮中备用.
　　1.2.2免疫组化检测Oatp2表达部位常规冰冻切片免疫组织化学SABC法检测脑、肝内Oatp2的表达部位. Oatp2 mAb工作浓度为3.125 mg/L，二抗为生物素标记的兔抗大鼠IgG工作溶液，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗生物素工作液后，DAB显色. 实验阴性对照：一抗以PBS代替.
　　1.2.3 Western Blot法检测Oatp2表达水平采用RIPA裂解液提取脑、肝总蛋白，BCA法进行蛋白定量；蛋白样品经10 g/L SDSPAGE电泳分离，半干法转至PVDF膜；一抗为兔抗大鼠Oatp2（3 mg/L），二抗为HRP标记羊抗兔IgG（1∶1000），ECL化学发光试剂作用后胶片显影图片扫描. 组织Oatp2的相对Mr为75 000，以actin（1∶5000）作为内参，Mr为42 000，以Oatp2 A值/ actin A值评价Oatp2的相对表达量.
　　1.2.4RTPCR检测Oatp2mRNA表达水平组织总mRNA提取参照说明书. 以βactin作为内参， 引物序列见表1，按TaKaRa公司RTPCR试剂盒说明书操作，扩增条件为： 94℃， 40 s，56℃， 40 s，72℃， 60 s，35个循环. PCR产物在质量分数为1.5 g/L的琼脂糖凝胶电泳后溴化乙錠染色，扫描定量，根据Oatp2带A值/βactin带A值评价Oatp2基因的相对表达量. 表1Oatp2和βactin引物序列统计学分析： 所有数据使用SPSS12.0进行统计分析，计量资料以x±s表示，不同组间比较采用方差分析及LSDt检验，以P&<0.05为有统计学差异.
　　2结果
　　2.1Oatp2在脑、肝组织的定位免疫组化DAB显色后，脑、肝内均见棕黄色Oatp2免疫反应阳性细胞（图1），阴性对照无着色. 脑内Oatp2阳性细胞广泛分布于脉络丛上皮细胞膜及脑微血管内皮细胞膜；在肝内则主要分布于肝细胞膜. 痫性发作和AEDs干预不影响脑、肝内Oatp2表达部位.
　　A：脉络丛Oatp2×400； B：脑微血管Oatp2×200；　C：肝内Oatp2×200.
　　图1Oatp2在脑、肝表达的免疫组化检测
　　2.2AEDs对脑、肝内Oatp2表达的影响用Western blot检测发现（表2，图2），正常Wistar鼠给予VPA， CBZ， PHT治疗后，三种AEDs均可使鼠脑内Oatp2蛋白表达降低（P&<0.05），而癫痫鼠给予同样的AEDs治疗后，脑内Oatp2表达同样也较正常对照下降（P&<0.05）. 但AEDs影响脑内Oatp2蛋白改变的程度，在正常与癫痫大鼠间并无统计学差异. 可见，除痫性发作可致脑内Oatp2变化外，AEDs本身也可致其脑内表达的变化. 而与脑内Oatp2的表达不同，肝内Oatp2的表达仅受AEDs的影响， 表现为无论正常大鼠还是癫痫大鼠，其肝内Oatp2蛋白表达在CBZ， PHT干预后表达增加，而在VPA干预后表达下降. 用RTPCR检测发现（表2，图3）， 癫痫组、不同药物治疗组脑内Oatp2mRNA表达与正常组相比无差异. 且肝内Oatp2mRNA表达与其蛋白水平的变化具有一致性. 表2AEDs对脑、肝内Oatp2表达影响 　　3讨论
　　研究提示，在对癫痫长达数年的AEDs治疗中，AEDs除抑制痫性发作外，也通过诱导Pgp表达而影响脑内AEDs浓度，而本组予以正常大鼠连续使用VPA， CBZ， PHT 4 wk，发现实验组大鼠脑内Oatp2表达均较正常对照下降，提示此3种AEDs可抑制脑内Oatp2的表达. 针对临床上耐药癫痫患者均有AEDs治疗后仍有反复惊厥发作的状况，本组对癫痫大鼠进行相同的AEDs治疗，结果发现，癫痫大鼠经AEDs治疗后其脑内Oatp2的表达水平均显著低于正常对照，但与未治疗的癫痫对照组相比，治疗组脑内Oatp2的表达并无显著性差异，提示尽管痫性发作和AEDs均可抑制脑内Oatp2的表达，但二者对抑制Oatp2表达的效应无协同作用，这与AEDs和痫性发作协同诱导大鼠脑内Pgp表达增加有差异［6］. 与蛋白水平不同，应用AEDs后脑内Oatp2mRNA不存在类似变化，推测脑内Oatp2表达可能存在转录后调控，AEDs和痫性发作可能是其转录后调控因子.
　　多种AEDs均经肝脏代谢，而代谢酶是肝脏代谢的主要途径，除以细胞色素P450为代表的Ⅰ相代谢酶和以葡萄糖醛酸转移酶为代表的Ⅱ相代谢酶外，以OATP为代表的膜转运蛋白对药物代谢也有重要作用，被称作Ⅲ相代谢酶［7］. 本研究发现肝细胞膜上存在Oatp2的表达，提示肝内Oatp2的表达变化将影响肝脏的代谢. 众所周知， CBZ， PHT等AEDs可诱导Ⅰ， Ⅱ相代谢酶的变化，对其自身及其它AEDs的代谢产生影响. 本实验提示，在正常及癫痫大鼠体内，VPA可抑制肝内Oatp2表达，而CBZ及PHT则诱导其表达，这与VPA， CBZ， PHT对Cytc p450等代谢酶的抑制或诱导的效应类似. 与脑内Oatp2表达不同，本组发现肝内Oatp2表达不受痫性发作的影响.
　　Oatp2是否影响AEDs的体内过程尚不明确，结合Oatp2与Pgp在大鼠脑内的分布的一致性，而痫性发作和AEDs在促进脑内Pgp表达同时，却抑制Oatp2表达，而表达增加的Pgp能降低靶组织内AEDs浓度而参与癫痫耐药，推测Oatp2在癫痫耐药中可能具有与Pgp不同的作用.

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