关于固相萃取高效液相色谱法测定司他夫定的血药浓度

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【关键词】 固相萃取法 高效液相色谱法 司他夫定 血药浓度
　　 0引言
司他夫定(stavudine)是人类免疫缺陷病毒（HIV）逆转录酶抑制剂. 司他夫定被胸苷激酶磷酸化后形成有活性的代谢物三磷酸司他夫定，抑制HIV逆转录酶而干扰病毒DNA的合成，临床上用于治疗HIV感染. 我们旨在摸索一种简便、快速、专属性高的测定司他夫定血浆浓度的方法，为司他夫定药动学研究提供指导.
　　1材料和方法
　　1.1材料高效液相色谱仪（SPD10Avp，日本岛津公司）；BF2000固相萃取系统，Bond ODSC18固相萃取小柱（3 mL/200 mg， Agilent Techologies）；受试制剂：司他夫定胶囊（批号：041103；规格：每粒40 mg；武汉五景药业有限公司）；参比制剂：司他夫定胶囊（批号：040601；规格：每粒20 mg；纯度：99.96%；上海迪赛诺生物医药有限公司）；内标：地丹诺辛（2，3Dideoxyinosine，98%，美国SIGMA公司）；乙腈和甲醇（色谱纯，TEDIA公司）；磷酸胺和磷酸（分析纯，天津广成试剂公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1色谱条件采用Turner C8柱（250 mm×4. 6 mm I.D.，5 μm）；流动相：乙腈0.05 mol/L磷酸胺（5∶95，V/V），磷酸调pH=6.75；流速：1 mL/min；检测波长：260 nm［1］.
　　1.2.2定性获取空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的二维色谱图，比较所测成分的保留时间及检测波长是否一致.
　　1.2.3血浆样品的预处理取0.5 mL血浆样品，加入0.5 mL内标溶液（0.1 mg/L），充分混合后转移至预先依次用2 mL甲醇、2 mL 0.05 mol/L磷酸胺活化过的固相萃取小柱，依次用2 mL 0.05 mol/L磷酸胺、0.5 mL去离子水淋洗，并弃去淋洗液，然后用2 mL甲醇洗脱，收集洗脱液至洁净样品管中，在40℃下用氮气流吹干，残渣用0. 5 mL流动相溶解，取50 μL进行HPLC分析.
　　1.2.4标准曲线的制备取健康人空白血浆0.5 mL数份，加入司他夫定标准品，使其浓度分别为0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/L，按血浆样品项处理后作HPLC分析，以待测物与内标物的峰面积比值对药物浓度进行回归，计算回归方程.
　　1. 2. 5回收率与精密度考察配制含司他夫定的标准品0.05，0.5，1.0 mg/L的系列血样，日内各浓度重复进样5次，日间各浓度测定1次，连续测定5 d，以所测浓度与已知浓度相比，计算血样中司他夫定的相对回收率和日内、日间精密度.
　　2结果
　　2.1色谱分离与定性从加入标准品的血浆样品的二维色谱图可知，司他夫定和内标（地丹诺辛）分别在11.6 min和8.8 min出峰，比较空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的色谱图，司他夫定和内标的保留时间基本一致，证明定性成功.

2.2线性关系回归方程：Y=3.2595X+0.0209，相关系数（r）=0.9996 (n=7)，线性范围0.02~2.0 mg/L. 相关系数的显著性检验P＜0.001. 本色谱条件下的最低检测浓度为0.02 mg/L.
　　2.3精密度与回收率血样中司他夫定的相对回收率和日内、日间精密度见表1. 血样中司他夫定的相对回收率为79.5%~88.3%，日内、日间精密度小于10%，符合生物样品分析的有关要求. 表1人血浆中司他夫定的精密度和回收率
　　3讨论
　　测定血浆中司他夫定浓度的方法有反相高效液相色谱法、衍射紫外分光光谱法［2］、高效液相质谱仪联用法［3-4］等. 我们采用固相萃取高效液相色谱法，实验以乙腈0. 05 mol/L磷酸胺（5∶95，V/V）为流动相，结果发现，流动相pH值对司他夫定和内标的出峰时间以及峰形有显著影响，调流动相pH=6.75能获得最佳效果. 本实验方法简便，特异性和重现性好，准确度、精密度、灵敏度均符合要求.

【参考文献】
［1］ Verweijvan Wissen CP， Aarnoutse RE， Burger DM. Simultaneous determination of the HIV nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors lamivudine， didanosine， stavudine， zidovudine and abacavir in human plasma by reversed phase high performance liquid chromatography［J］. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2005，25，816(12):121-129.

［2］ Kapoor N， Khandavilli S， Panchagnula R. Simultaneous determination of lamivudine and stavudine in antiretroviral fixed dose combinations by first derivative spectrophotometry and high performance liquid chromatography［J］. Pharm Biomed Anal， 2006 ［Epub ahead of print］.

［3］ Wiesner JL， Sutherland FC， Smit MJ， et al. Sensitive and rapid liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the determination of stavudine in human plasma［J］. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2002，25，773(2):129-134.

［4］ Pruvost A， Becher F， Bardouille P， et al. Direct determination of phosphorylated intracellular anabolites of stavudine (d4T) by liquid chromatography/tandem mass spectrometry［J］. Rapid Commun Mass Spectrom， 2001，15(16):1401-1408.

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