关于原发性肝细胞癌患者免疫功能的改变

　　　　　　　　作者：秦东春　王海颖　梅园丁　张钦宪

【摘要】 　　目的： 了解原发性肝细胞癌(HCC)患者免疫功能的变化. 方法： 应用流式细胞术对45例来自不同分期的原发性肝癌患者外周血、肿瘤组织和30例正常人外周血CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， CD4+CD25+， CD4+CD25+CTLA4+T淋巴细胞亚群的比例进行分析比较，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中细胞因子白细胞介素2(IL2)和转化生长因子β1(TGFβ1)水平. 结果： 不同分期HCC患者外周血淋巴细胞总数低于正常对照组，CD4+CD25+Treg及CD4+CD25+CTLA4+T细胞比例均高于正常对照组，差异有统计学意义. 而不同分期原发性肝癌患者外周血中CD4+比例、CD8+比例及CD4/CD8比值与正常对照组比较，差异均无统计学意义. 不同分期原发性肝癌患者肿瘤组织中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率高于正常对照组，差异均有统计学意义. 与对照组比较，原发性肝癌患者各组IL2水平均下降；T1~T3期组TGFβ1水平高于对照组，但T4期组TGFβ1水平低于对照组. 结论： 原发性肝癌患者存在明显的细胞免疫功能紊乱和抗肿瘤免疫功能低下. 在肝癌患者外周血及肿瘤组织中CD4+CD25+Treg所占比例均有明显升高，提示CD4+CD25+Treg可能是原发性肝癌免疫抑制的一个重要原因. TGFβ1， IL2分子水平检测有助于肝癌患者诊断和预后判断.
【关键词】 癌，肝细胞；T淋巴细胞 ； 转化生长因子β1； 免疫功能
　　【Abstract】 AIM: To study the change of immunological functions in patients with primary hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: The tumor tissue and peripheral blood samples were collected from 45 patients with every stage HCC; meanwhile， peripheral blood samples were taken from 30 healthy people. The populations of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， CD4+CD25+， CD4+CD25+CTLA4+ T subsets were evaluated by flow cytometry and the levels of IL2 and TGFβ1 were determined by ELISA. RESULTS: The total numbers of lymphocytes in peripheral bloods samples from different stages of HCC were lower than those of the healthy controls. The percentages of CD4+CD25+Treg and CD4+CD25+CTLA4+T cells were higher than those of the healthy controls. These differences were of statistical significance. But， compared with healthy controls， the differences of the proportions of CD4+ T cell and the CD4/CD8 ratios at different stages of HCC were not statistically significant. Compared with healthy controls ， the level of IL2 in HCC groups decreased， the level of TGFβ1 in T1T3 stage HCC groups increased， and the one in T4 stage HCC group decreased. CONCLUSION: HCC patients have a cellular immunity dysfunction and a poor antitumor immune response. The percentage of CD4+CD25+Treg in peripheral blood and tumor tissue is significantly higher than that in peripheral blood of the healthy controls， which may be one of the important reasons of immunosuppression in HCC. The determination of TGFβ1 and IL2 levels are helpful to diagnose HCC and predict the prognosis of HCC patients.
　　【Keywords】 carcinoma， hepatocellular; Tlymphocytes; transforming growth factorbeta1; immune function
　　0引言
　　原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一. 已证实机体的免疫状况与恶性肿瘤的发生和发展有着密切的联系［1］. 当宿主的免疫功能低下或受到抑制时，肿瘤发生率高，且肿瘤一旦发生又可通过其产生的免疫抑制因子进一步抑制机体的防御机能. 目前已证实免疫系统功能紊乱在肝癌发生中起着极为重要的作用. 监测机体免疫系统某些因子的变化，可以做为肝癌发生、发展、预防以及疗效、预后判定的客观指标. 本文拟就不同分期的原发性肝癌患者细胞免疫功能的变化进行了检测，以期为临床预防、治疗提供有益的帮助.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　按照随机取样的原则收集河南省肿瘤医院肝胆外科20060301/0801经手术切除并病理确诊的原发性肝癌45例，术前均无化疗及免疫治疗，排除免疫相关性疾病. 年龄在32~65岁，中位年龄48岁，术前收集外周血、术中采集患者肝肿瘤组织；收集该院体检排除肿瘤及免疫相关性疾病的健康人30例外周血为对照组. 在原发性肝癌组中，T1期(单个结节，直径≤2 cm，无血管侵犯)10例，T2期(单个结节，直径≤2 cm侵犯血管；或单个结节＞2 cm，未侵犯血管)11例，T3期(单个结节≥2 cm，侵犯血管；或多个结节局限一叶，直径≤2 cm，侵犯血管；或多个结节局限一叶，直径＞2 cm，伴或不伴有血管侵犯)14例，T4期(多个结节，超出一叶；或侵犯门静脉主支或肝静脉，局部淋巴结转移)10例.
　　
　　淋巴细胞分层液(上海奇康生物科技有限公司)；台盼蓝染液(Chroma 进口分装)；HBSS液 (宝信生物公司)；1.4 g/L胶原酶(宝信生物公司)；1 g/L DNA酶(宝信生物公司)；植物血凝素(PHA，宝信生物公司)；CYlabeled mouse antihuman CD3， PElabeled mouse antihuman CD4， PElabeled mouse antihuman CD4， FITClabeled mouse antihuman CD25， PElabeled mouse antihuman CD152，同型对照IgGα1(pharmingen ，USA)；IL2ELISA定量试剂盒，TGFβ1ELISA定量试剂盒(上海复星长征医学公司). Multiskan Ascent 354全自动酶标仪(雷勃公司，芬兰)；EPICSXCL型流式细胞仪 (Beckman Coulter， USA).
　　1.2方法
　　1.2.1分离制备
　　TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)将切除的肿瘤组织放入含抗生素的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中，HBSS液中无Ca2+， Mg2+，含100 μg/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，50 μg/mL庆大霉素，去除坏死脂肪及其他正常组织，然后剪成碎块(＜1 mm3). 将组织碎块移入含1.4 g/L胶原酶和1 g/L DNA酶的RPMI1640混合液，搅拌45 min. 将酶消化后的混合液经不锈钢网(100目)过滤除去细胞团块. 将过滤细胞用HBSS液洗2次(1500 r/min，10 min).
　　将1000 g/L聚蔗糖泛影葡胺分层液2 mL置离心管底层，其上叠加等体积的750 g/L聚蔗糖泛影葡胺，将已制备好的瘤组织单细胞悬液缓慢加至最上层做不连续密度梯度离心，1500 r/min，离心20 min. 在上下两层聚蔗糖泛影葡胺分层液之间界面上收获TIL细胞悬液. 将TIL细胞悬液移入另一离心管中，用HBSS液洗3遍(1500 r/min，10 min)，即得到TIL制备物.
　　1.2.2细胞表面CD抗原测定以流式细胞仪检测
　　各组PBMC和TIL膜表面CD3， CD4， CD8， CD25，细胞内CD152表达率.
　　1.2.3血清IL2， TGFβ1浓度测定
　　稀释标准品浓度为1.0， 0.5， 0.25， 0.125， 0.063， 0.031， 0.016和0 pg/L. 取出酶标板，分别标准品或样品，每孔加100 μL，设复孔， 封住板条， 37℃孵育120 min. 洗板6次，在滤纸上印干. 每孔加入一抗工作液100 μL，封住板条， 37℃， 60 min. 洗板6次，在滤纸上印干. 每孔加入酶标抗体工作液100 μL，封住板条，37℃， 60 min. 洗板6次，在滤纸上印干. 每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗处反应10 min，每孔加入1滴终止液混匀终止反应，在492 nm处测吸光值. 绘标准曲线，并推算各样本的浓度.
　　统计学处理：实验数据以x±s表示. 应用SPSS10.0统计软件进行分析，先作方差齐性检验，若方差齐，采用单因素的方差分析及两两比较的q检验. 方差不齐，采用秩和检验. P&<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1不同分期原发性肝癌患者T淋巴细胞亚群比例变化不同分期原发性肝癌患者与正常对照组间外周血中淋巴细胞总数、CD4+CD25+ 调节性T淋巴细胞及CD4+CD25+CTLA4+T淋巴细胞比例的差异均有统计学意义(分别是F=4.421，P=0.026，F=12.864，P=0.001，F=23.664，P=0.000)，而不同分期原发性肝癌患者与正常对照组间外周血中CD4+比例、CD8+比例及CD4/CD8比值的差异均无统计学意义(分别是F=1.116，P=0.402，F=0.813，P=0.545，F=2.347，P=0.125). 两两比较，外周血淋巴细胞总数：T3， T4期低于正常对照组(P&<0.05)，T1期高于T4期(P&<0.05)；CD4+CD25+调节性T淋巴细胞比例：T2， T3， T4期低于正常对照组(P&<0.05)，T1期低于T3， T4期(P&<0.05)，T2期低于T4期(P&<0.05)；CD4+CD25+CTLA4+T淋巴细胞比例：T1， T2， T3， T4期低于正常对照组(P&<0.05)，T1期低于T3，T4期(P&<0.05)，T2期低于T3，T4期(P&<0.05，表1).表1不同分期原发性肝癌和正常对照组之间外周血T淋巴细胞亚群(略)
　　2.2原发性肝癌患者外周血和肿瘤组织中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率变化不同分期原发性肝癌患者与正常对照组间外周血和肿瘤组织中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率的比较差异均有统计学意义(分别是F=148.725，P&<0.05，F=116.908，P&<0.05). 两两比较，外周血中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率：T1， T2， T3， T4期均高于正常对照组(P&<0.05)，T1期低于T2， T3， T4期(P&<0.05)，T2期低于T4期(P&<0.05)；肿瘤组织中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率：T1， T2， T3， T4期均高于正常对照组(P&<0.05)，从T1期到T4期肿瘤组织中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率依次升高(表2).表2不同分期原发性肝癌患者外周血和肿瘤组织CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率(略)
　　2.3原发性肝癌患者血清IL2， TGFβ1水平不同分期原发性肝癌患者与正常对照组间血清中TGFβ1， IL2水平的比较差异均有统计学意义(分别是F=4.411， P=0.026， F=20.498， P&<0.05). 两两比较结果显示，血清中IL2水平： T2， T3， T4期均低于正常对照组(P&<0.05)；血清中TGFβ1水平：T2， T3， T4期均高于正常对照组(P&<0.05)，T1， T2， T3期均低于T4期(P&<0.05)，T1期低于T3期(P&<0.05，表3).表3不同分期原发性肝癌患者血清IL2， TGFβ1水平(略)
　　3讨论
　　肝脏具有独特的免疫系统，是机体最大的专职天然免疫功能的器官［2-3］，在机体的整体和局部免疫调节方面发挥作用. 肝癌发生和发展的过程伴随着一系列免疫状态的变化. 肝癌术后复发及转移的机理复杂，与患者免疫系统功能低下有密切关系.
　　
　　CD4+CD25+Treg细胞是近年来鉴定出的一种新型免疫抑制细胞，天然CD4+CD25+Treg细胞来源于胸腺，但也可以在持续性抗原刺激及IL10等细胞因子条件下在外周诱导产生，它具有免疫无能性和免疫抑制性两大特征［4］，可能是通过细胞之间直接接触的方式抑制其他免疫细胞的功能，如抑制CD4+CD25+T细胞和CD8+CD25T细胞、NKT细胞的增殖及分泌IL2的功能、抑制CD8+记忆性T细胞的反应能力、下调DC的表面共刺激分子的表达、降低抗原递呈的效率等［5-8］. CD4+CD25+Treg几乎抑制目前所有已知的先天的和继发的免疫反应，被认为是迄今为止所发现的最重要的免疫抑制细胞，在肿瘤的免疫抑制中发挥重要作用. 关于CD4+CD25+Treg在肿瘤患者免疫抑制方面的临床研究报道甚少. 以CD4+CD25+为标志，IchiharaF等报道胃癌患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞比例为(14.2±4.9)%，食道癌为(19.8±6.9)%，均高于正常对照组(7.2±2.1)%［9］，随后在晚期卵巢癌和黑色素瘤患者外周血中也观察到类似现象［10-13］.
　　本研究分析结果显示，不同分期HCC患者外周血淋巴细胞总数低于正常对照组，CD4+CD25+Treg及CD4+CD25+CTLA4+T细胞比例均高于正常对照组. 提示，CD4+CD25+Treg及CD4+CD25+CTLA4+T在患者体内的高含量是造成原发性肝细胞癌患者免疫抑制的主要原因之一. 结果还显示，CD4+CD25+Treg比例与患者肿瘤临床分期存在一定的相关性，提示CD4+CD25+Treg的表达与肿瘤的进程有关. 由于本组样本量较少，未能探讨原发性肝细胞癌患者外周血中CD4+CD25+Treg的含量与患者年龄、性别、病理类型之间的关系.

转贴于 　　CD25+为IL2受体α链，也是T细胞活化的标志之一，CD4+CD25+ T细胞也包含了部分活化的CD4+ T细胞，持续性表达 CTLA4是CD4+CD25+Treg细胞的特征之一，而且在其发挥抑制功能中起重要作用. 本课题特设计对CD4+CD25+Treg细胞进行CD152+的测定. 结果显示，不同分期原发性肝癌患者外周血和肿瘤组织中CD4+CD25+CTLA4+T细胞阳性率与正常对照组比较增高，差异有统计学意义. 提示，CD4+， CD25+， CD152+表面标志的检测能更好地反映调节性T细胞数量.
　　白细胞介素2 ( IL2) 是由淋巴细胞和其它细胞在抗原或分裂原激活后产生，是分子量为15 ku的可溶性糖蛋白，是机体免疫细胞产生的一类抗肿瘤、参与免疫调节的细胞因子，外周血IL2水平可以反映出肿瘤患者机体的免疫水平和抗肿瘤能力.
　　一些研究发现，肿瘤患者局部TGFβ1表达异常，患者血清TGFβ1水平也存在异常改变，而且血清TGFβ1水平升高与肿瘤进展、预后不良具有一定相关性. 关于原发性肝癌患者与TGFβ1的关联性研究报道较少.
　　本研究结果显示，患者血清中IL2水平较对照组下降. 未经酸化处理的血清标本内检测不到TGFβ1， TGFβ1在血清中以潜活形式存在. 原发性肝癌组TGFβ1水平高于正常对照组. 结果还显示，血清中IL2水平： T2， T3， T4期均低于正常对照组；血清中TGFβ1水平： T2， T3， T4期均高于正常对照组，T1， T2， T3期均低于T4期，T1期低于T3期. 提示，肝癌患者存在IL2分泌抵制状况. 患者血清中IL2和TGFβ1的表达与肿瘤分期、分级和肿瘤进展密切相关，原发性肝细胞癌患者血清IL2和TGFβ1的检测有助于肝癌患者诊断和预后判断.

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