关于钙调神经磷酸酶在醛固酮致心肌成纤维细胞增殖中的作用

　　　　　　　　 作者：张冀东，崔炜，王永利，张海林，武宇洲，鲁静朝，杨晓红，都军，刘凡，谢瑞芹

【摘要】 　　目的： 检测醛固酮(Ald)诱导的心肌成纤维细胞（CFs）增殖中钙调神经磷酸酶（CaN）mRNA，蛋白表达及螺内酯(Spi)，环孢素A（CsA）对其表达的影响，从而探讨CaN在Ald致心肌纤维化中的作用. 方法： 本研究以体外培养的新生SD大鼠CFs为研究对象，以Ald诱导其增殖和胶原合成，并加入CsA， Spi干预，应用 RT PCR和Western Blot分别测定CaN mRNA和蛋白表达的变化. 结果： 与对照组相比，Ald组促进CFs增殖和增加羟脯氨酸含量（P＜0.05)，与Ald组相比，Ald+CsA组，Ald+Spi组则可以明显抑制CFs增殖和减少羟脯氨酸含量（P&<0.05）；与对照组相比，Ald 组CaN mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性升高（P&<0.05），与Ald组比较，Ald+CsA组，Ald+Spi组的CaN mRNA，蛋白表达均降低（P&<0.05）. 结论： 外源性Ald可通过CaN依赖的信号转导通路诱导心肌纤维化，其作用与Ald的基因组通路有关.
【关键词】 钙神经素；醛固酮；心肌；成纤维细胞；螺内酯；环孢菌素
　　【Abstract】 AIM: To investigate the role of calcineurin (CaN) in aldosterone (Ald)induced proliferation of cardiac fibroblasts (CFs) by testing the expressions of CaN mRNA and protein and to explore the effects of spironolactone (Spi) and cyclosporine A (CsA) on CaN expression. METHODS: In the cultured CFs of neonatal SD rat， the effects of Ald， Spi and CsA on proliferation were measured by MTT colorimetric assay， synthesis of collagen was observed by determining the hydroxyproline concentration， and CaN mRNA and protein were tested by RTPCR and Western Blot， respectively. RESULTS: Compared with the control group， the proliferation of the fibroblasts and the hydroxyproline concentration were significantly increased in Ald group (P&<0.05). Compared with Ald group， the proliferation of the fibroblasts and hydroxyproline concentration were significantly inhibited in Ald+Spi group and Ald+CsA group， respectively (P&<0.05). Compared with the control group， CaN mRNA and protein were upregulated in Ald group (P&<0.05)， but the increased expressions of CaN mRNA and protein were inhibited in Ald+CsA group and Ald+Spi group respectively (P&<0.05). CONCLUSION: Exogenous Ald can stimulate CFs proliferation and collagen synthesis through a CaNdependent signal pathway. The effects of Ald are realized in agenomic way.
　　【Keywords】calcineurin; aldosterone; myocardium; fibroblasts; spironolactone; cyclosporine
　　0引言
　　CaN在心肌细胞肥大中起重要作用［1］. 目前，有关CaN的研究大都集中在心肌细胞肥大上，在心肌纤维化上的研究很少. 我们以前的研究表明，Ald能剂量依赖性降低CFs的iNOSNO系统活性，促进CFs增殖，Spi能逆转此作用［1］. 为了探讨CaN是否参与了Ald诱导CFs增殖的作用，本研究以体外培养的新生SD大鼠CFs为研究对象，以Ald诱导其增殖和胶原合成，并加入Spi和CaN特异性抑制剂环孢霉素A（CsA）干预后，观察CaN mRNA和蛋白的表达变化，从而深入了解Ald致心肌纤维化的机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　出生1～3 d的SD大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供；DMEMF12培养液为美国GIBCO公司产品；胰蛋白酶， MTT， DMSO， Ald， Spi， CsA为美国Sigma公司产品；胎牛血清购于兰州民海生物公司；羟脯氨酸试剂盒购于南京建成生物公司；大鼠波形蛋白mAb，羊抗鼠CaN抗体、HRP标记二抗为美国Santa Cruz生物公司；Trizol为美国Invitrogen生物公司；RT Reagents， PCR Reagents， DNA Marker 为日本TaKaRa生物公司.
　　1.2方法
　　1.2.1CFs培养及鉴定
　　取1~3 d龄的SD大鼠，无菌开胸，剪取心室，用DHanks液清洗，剪碎. 用1.25 g/L胰蛋白酶+ 0.1 g/L EDTA消化液反复消化后，分别收集各次消化细胞悬液，加入100 mL/L 胎牛血清的DMEMF12培养基，离心，弃上清液，加100 mL/L胎牛血清的DMEMF12培养基，制成细胞悬液，接种培养瓶中，置37℃， 50 mL/L CO2培养箱内培养. 根据CFs比心肌细胞贴壁速度快，差速贴壁60 min，倾去上层未贴壁细胞，剩余的即为CFs. 加入100 mL/L 胎牛血清的DMEMF12培养液继续培养. 经倒置显微镜、免疫组化波形蛋白mAb阳性鉴定为所需要的CFs，细胞纯度达96%. 待CFs生长接近融合时以1∶3传代，实验用3～4代细胞.
　　1.2.2实验分组
　　实验分6组: 10 mL/L胎牛血清的DMEMF12培养液为空白对照组，1×10-7 mol/L Ald组，1×10-8 mol/L Ald组，1×10-9 mol/L Ald组，1×10-7 mol/L Ald+1×10-8 mol/L Spi组，1×10-7 mol/L Ald +1×10-7 mol/L CsA组.
　　1.2.3MTT法测定
　　细胞增殖取对数生长期CFs 5×107/L接种于96孔板中，37℃， 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养24 h后换无血清培养基，继续培养24 h后，使细胞进入生长静止期. 吸弃各孔培养基， 分别加不同浓度的药物，继续培养72 h. MTT法检测各组CFs的增殖，在酶联免疫检测仪上490 nm处测定A值.
　　1.2.4羟脯氨酸测定
　　取对数生长期CFs 5×108/L接种于24孔板中，37℃， 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养24 h后换无血清培养基，继续培养24 h后，使细胞进入生长静止期. 吸弃各孔培养基， 分别加不同浓度的药物，继续培养72 h. 操作步骤按羟脯氨酸试剂盒说明进行.
　　1.2.5RTPCR测定
　　CaN mRNA的表达取对数生长期CFs 5×109/L接种于50 mL培养瓶中，37℃， 50 mL/L CO2及饱和湿度下培养24 h后换无血清培养基，继续培养24 h后，使细胞进入生长静止期. 吸弃培养基， 分别加不同浓度的药物，继续培养72 h. 按照Trizol试剂的说明提取出总RNA. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳法鉴定RNA的完整性，紫外光分光光度计测定RNA 的A260/A280鉴定RNA的纯度. 取合乎要求的总RNA 1 μg，先逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增. 引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成. CaN 引物(244 bp) ：上游引物5′ACT GGC ATG CTC CCC AGC GGA3′，下游引物5′GTG CCG TTA GTC TCT GAG GCG3′. 内参照为β肌动蛋白(587 bp) ：上游 5′CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C3′，下游5′AGG GTA CAT GGT GGT GGC GCC AGA C3′. CaN 的PCR反应条件: 94℃ 2 min，（94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s）/30个循环，延伸72℃ 10 min. β肌动蛋白的反应条件：94℃ 2 min，（94℃ 30 s， 58℃ 50 s，72℃ 90 s）/30个循环，延伸72℃ 10 min. 反应结束后，取PCR产物6 μL，在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分A的比值表示.
　　1.2.6Western Blot测定
　
　　CaN 蛋白的表达细胞培养和药物干预步骤同上. 细胞离心收集，用细胞裂解液裂解后加入等体积的2×SDS上样缓冲液，取上清液于100℃煮沸5 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样50 μg总蛋白. 利用水浴式电印迹法将蛋白转至PVDF膜上，室温下封闭膜2 h后，加入1∶250的一抗稀释液，室温振摇2 h，用TweenPBS液洗膜3遍. 再加入1∶8000的HRP标记二抗稀释液，室温振摇1 h后用TweenPBS液洗膜3遍. 将膜浸入DAB显色液中在室温下充分显色后立即用蒸馏水洗膜，将膜转入PBS液中，观察并照相，凝胶成像系统分析光密度值.
　　统计学处理：采用SPSS 12.0软件进行统计分析，实验数据用x±s表示， 进行单因素方差分析及LSDt检验进行组间的两两比较. P&<0.05为有统计学差异.

　　2结果
　　2.1各组CFs的增殖和羟脯氨酸测定与对照组相比，Ald组可明显增加CFs增殖和羟脯氨酸含量（P&<0.05）. 与Ald组比较，Ald+Spi， Ald+CsA组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显减少（P&<0.05）. 与Ald+Spi组比较，Ald+CsA组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显增加（P&<0.05，表1）. 羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在.
　　2.2各组CFs的CaN mRNA，蛋白测定与对照组相比，Ald组的CaN mRNA，蛋白水平均明显升高（P＜0.05），并呈浓度依赖性，10-7mol/L Ald组的CaN mRNA，蛋白水平明显高于10-8mol/L和10-9mol/L Ald 组（P＜0.05）. 与Ald 组相比，Ald+Spi，Ald+CsA组的CaN mRNA，蛋白水平明显降低（P＜0.05）. Ald+Spi组比较，Ald+CsA组的CaN mRNA，蛋白水平没有差异性(图1，2，表1).表1CFs的增殖、羟脯氨酸、CaN mRNA和蛋白的表达(略）
　　3讨论
　　CaN是胞内Ca2+信号诱导核内肥大基因活化的中心环节［2-3］. CaN是一个由Mr×103为61的催化A亚基和19的调节B亚基组成的二聚体，A亚基与CaM结合，B亚基与钙结合. 在心肌细胞中，当钙、CaM分别结合至CaN的调节和催化亚单位时，CaN活化并直接与胞浆活化T细胞因子3(NFAT3)结合，使NFAT3氨基端调节区去磷酸化并转位入核. NFAT3可诱导心脏胚胎期基因如心钠素（ANP），脑型利钠素（BNP），β肌球蛋白重链（βMHC）等的表达，引起心肌重构［4］. 研究已证实心肌能通过自分泌或旁分泌方式产生醛固酮，心肌局部的醛固酮比血液中浓度高17倍，其可促进CFs增殖和胶原合成，在心肌纤维化中起着重要的作用［5］. 本研究显示，外源性醛固酮可诱导CFs增殖和胶原合成，同时呈浓度依赖性升高CaN mRNA、蛋白水平，而CaN特异性抑制剂CsA可抑制Ald诱导的CFs增殖和胶原合成，并降低CaN mRNA、蛋白表达，提示CaN信号通路参与了Ald致心肌纤维化的过程.
　　Ald信息通路包括基因组通路与非基因组通路. 基因组通路指经盐皮质激素受体（MR）介导的信号通路，Ald与MR结合后脱离热休克蛋白，入核与基因组激素应答元件(HRE) 结合并调控转录，如上调AngⅡ1 型受体(AT1R) mRNA转录［6］，激活KRas信号转导通路［7］等，MR拮抗剂Spi能阻断此条通路. 非基因组通路是Ald经细胞膜受体，在短时间内激活胞内磷酯酶C (PLC)，激活Na+K+泵等来发挥作用，MR拮抗剂Spi不能阻断此条通路. 有实验表明，Ald增加心肌收缩力和血管收缩的作用是通过非基因组通路介导的，而Ald对细胞的DNA和胶原合成的影响是通过基因组通路介导的［8］. 本实验表明，Spi在逆转Ald促进CFs增殖和胶原合成的同时，降低CaN表达，说明Ald上调CaN表达是通过MR介导的基因组通路的. 另外本实验观察到，与Ald+Spi组比较，Ald+CsA组的CFs增殖和羟脯氨酸含量明显增加，而CaN mRNA，蛋白水平没有差异性，提示CaN特异性抑制剂CsA在明显抑制CaN mRNA，蛋白水平时，不能完全抑制Ald诱导的CFs增殖和胶原合成，CaN信号只是Ald致心肌纤维化的众多信号通路的一种.
【

参考文献

】
　　［1］冯惠平，崔炜，单保恩，等. 醛固酮降低新生大鼠心肌成纤维细胞iNOS 表达和NO 含量［J］. 基础医学与临床，2005， 25(2): 152-155.

　　［2］林瑶，牛勃，解军，等. SiRNA对大鼠钙调神经磷酸酶活性及VSMCs增殖的影响［J］. 第四军医大学学报，2006，27(18):1687-1689.

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　　［4］Liang Q， De Windt LJ， Witt SA， et al. The transcription factors GATA4 and GATA6 regulate cardiomyocyte hypertrophy in vitro and in vivo［J］. J Biol Chem， 2001， 276(32): 30245-30253.

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　　［6］Robert V， Heymes C， Silvestre JS， et al. Angiotensin AT1 receptor subtype as a cardiac target of aldosterone: role in aldosteronesaltinduced fibrosis［J］. Hypertension， 1999， 33(4): 981-986.

　　［7］Stockand JD， Meszaros JG. Aldosterone stimulates proliferation of cardiac fibroblasts by activating KiRasA and MAPK1/2 signaling［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2003， 284(1): H176-H184.
　
　　［8］Chai W， Garrelds IM， Arulmani U， et al. Genomic and nongenomic effects of aldosterone in the rat heart: why is spironolactone cardioprotective?［J］. Br J Pharmacol， 2005， 145(5): 664-671.

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