关于SP600125－JNK抑制剂对大鼠脑缺血再灌注神经元的保护作用

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　　　　　　　　 作者：王宁　薛荣亮　姚凤珍　何家璇

【摘要】 　　目的： 探讨SP600125JNK特异性抑制剂对大鼠脑缺血再灌注神经元损伤的保护性作用及其作用机制. 方法： 雄性SD大鼠108只，体质量290~310 g，随机分成假手术组（SH组），缺血再灌注组（IR组），JNK抑制剂SP600125组（SP组），分别于缺血前30 min侧脑室注射10 mL/L DMSO， 10 mL/L DMSO及JNK抑制剂SP600125. 每组根据再灌注时间分为2， 6， 12， 24， 48和72 h 6个亚组，每亚组6只动物. 采用4VO法建立SD大鼠全脑缺血模型，在预定时间点行灌注、固定、取脑、石蜡包埋切片，光镜下计数CA1区存活细胞，TUNEL法检测CA1区凋亡细胞，免疫组化检测DNA修复蛋白Ｘ线修复交叉互补蛋白1（XRCC1）的表达变化. 结果： 脑缺血再灌注后海马CA1区神经元存活数目SP组高于IR组(P&<0.01)，凋亡细胞数目低于IR组(P&<0.01). SH组XRCC1表达量较强，IR组XRCC1的表达2 h即已开始下降，与SH组比较有统计学差异(P&<0.01). SP组XRCC1表达量的降低不明显，各时点与IR组比较均有统计学差异（P&<0.01）. 结论： 在大鼠全脑缺血再灌注损伤过程中，SP600125JNK特异性抑制剂对神经元起到了显著的保护性作用，其机制可能为抑制DNA修复蛋白下调的方式维护DNA修复功能，从而减少神经元的凋亡.
【关键词】 脑；脑缺血；再灌注损伤；细胞凋亡；JNK； XRCC1
　　【Abstract】 AIM: To investigate the neuroprotective effect of SP600125 on cerebral ischemia/reperfusion in rats and its possible mechanism. METHODS: 108 SD rats weighing 290~310 g were randomly pided into sham operation group(SH)， ischemia/reperfusion group(IR) or JNK inhibitor SP600125 group(SP). The rats were given 10 mL/L DMSO(SH group)， 10 mL/L DMSO(IR group) or SP600125(SP group) by intracerebral ventricular infusion 30 min before the ischemia， respectively. Whole brain ischemia（6 min）was induced by fourvessel occlusion， and the rats were fixed at specified time points after reperfusion for 2， 6， 12， 24， 48 and 72 h. The brains were removed， embedded and sliced up. The number of living/apoptotic neurons in hippocampal CA1 region was counted separately by histochemistry and TUNEL， and the activity of XRCC1 was detected by immunohistochemical technique. RESULTS: In SP group， the living neurons in hippocampal CA1 region were much more than those in IR group (P&<0.01)， and the apoptotic neurons were much less than those in IR group(P&<0.01). The XRCC1 in SH group was markedly expressed， whereas in IR group， the expression decreased(P&<0.01 vs SH group)， and the levels of XRCC1 in SP group were higher than those in IR group at different time pointas (P&<0.01). CONCLUSION: SP600125 protects the neurons from apoptosis and death in rat hippocampal CA1 region during whole brain ischemia/reperfusion injury， maybe via suppressing the reduction of DNA repair protein XRCC1.
　　【Keywords】 brain; brain ischemia; reperfusion injury; apoptosis;JNK; XRCC1
　　0引言
　　脑缺血再灌注导致DNA损伤，同时亦损伤了DNA的修复功能［1］，致神经元凋亡. 近期研究表明，MAPK信号通路之一JNK信号通路在脑缺血再灌注损伤过程中尤其是程序性细胞死亡过程中起着重要的调控作用［2］，但与DNA损伤修复有怎样的关系尚不清楚. 本实验我们采用大鼠全脑缺血再灌注模型，应用组织病理学、TUNEL法凋亡细胞检测、免疫组织化学等方法探讨JNK信号通路抑制剂SP600125对大鼠脑缺血再灌注神经元的保护作用，及其与DNA损伤修复蛋白XRCC1的关系，以进一步探讨脑缺血再灌注损伤的分子机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　成年雄性SD大鼠108只，体质量290~310 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供. 术前在20~25℃环境中饲养1 wk，术前夜禁食，随意进水. SP600125（购自美国Biosource公司），XRCC1抗体（购自美国Santa Cruz公司），原位末端细胞凋亡POD检测试剂盒（购自中国华美公司），DAB（购自北京中山试剂公司），戊巴比妥钠（购自西安）. DMSO（购自美国Santa Cruz公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1动物分组随机分成3组：假手术组（SH组）、缺血再灌注组（IR组）、JNK抑制剂SP600125组（SP组）. 每组根据再灌注时间不同再分为2，6，12，24，48和72 h 6个亚组，每亚组6只动物.
　　1.2.2模型制作采用4VO法［3］建立SD大鼠全脑缺血再灌注损伤模型. 10 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg对大鼠腹腔注射施行麻醉（所有动物麻醉均与此相同），仰卧位固定，颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线留置备用，缝合颈部切口. 改俯卧位固定，颈后正中切口，逐层分离肌肉，暴露第一颈椎翼小孔，用烧红的探针插入翼小孔，烧灼双侧椎动脉，使之永久闭塞. 放回鼠笼. 术后第2日，麻醉后仰卧位固定，剪开切口缝线，沿昨日留置线再次游离暴露双侧颈总动脉，予以微动脉夹夹闭6 min，松开微动脉夹恢复脑血流. 颈总动脉夹闭2 min内瞳孔不散大者弃之. SH组仅游离暴露双侧颈总动脉，不予微动脉夹夹闭. 三组动物在夹闭双侧颈总动脉前30 min分别侧脑室注射10 mL/L DMSO， 10 mL/L DMSO和SP600125（SP600125溶于10 mL/L DMSO，）各10 μL，药物在5 min内注完，留针2 min.
　　1.2.3组织学观察在预定时间点，10 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg对大鼠腹腔注射施行麻醉，开胸，经升主动脉依次灌注0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）100 mL和40 g/L多聚甲醛300 mL固定，取脑. 取视交叉后1~4 mm脑块进行石蜡包埋，冠状面切片，切片厚5 μm. 切片行HE染色，在400倍光镜下计数CA1区中段100单位长度内存活神经元数目.
　　1.2.4原位细胞凋亡TUNEL法检测
　　取海马冠状石蜡切片，常规二甲苯、乙醇脱蜡至水. 蛋白酶K（20 mg/L）室温消化，用甲醇配制的30 mL/L过氧化氢消除内源性辣根过氧化酶活性，加末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）与地高辛标记的dUTP混合反应进行孵育，再加辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体进行孵育，用DAB显色，核呈深棕黄色者为凋亡细胞，最后复染、脱水、透明、封片. 在400倍光镜下计数海马CA1区中段100单位长度内TUNEL染色阳性细胞数目. 定量分析方法为：光镜下计算凋亡指数（Apoptosis Index， AI）. 凋亡指数计算方法：分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI= 凋亡细胞数/总细胞数×100%.
　　1.2.5免疫组织化学取海马冠状石蜡切片，采用SABC法行免疫组化法. XRCC1多抗稀释度为1∶100. 切片依次脱蜡至水，30 mL/L过氧化氢孵育10 min，三蒸水冲洗5 min. PBS（pH 7.4）浸泡5 mim，电炉水浴抗原修复，加热至95℃15~20 min后，自然冷却至室温. 滴加正常山羊封闭血清，室温孵育1 h，侵去勿洗. 滴加1∶100的XRCC1多抗，放入4℃冰箱过夜. PBS冲洗5 min，3次，擦干切片周围水分后，滴加生物素标记的二抗，37℃温箱孵育1 h，PBS冲洗5 min，3次，擦干切片周围水分后，滴加SABC复合物，放入37℃温箱孵育20 min. 三蒸水洗5 min，3次，DAB显色，脱水、透明、封片. 采用Leica Qwin图像处理与分析系统进行图像分析. 每张切片取CA1区中1/3段测量平均灰度值代表XRCC1的表达水平，XRCC1的表达强弱与灰度值成反比.
　　统计学处理：计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSDt检验，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1组织学SH组HE染色，海马CA1区锥体细胞34层，排列紧密、整齐，细胞质呈淡红色，细胞核呈蓝黑色，高倍镜下细胞核大而圆，有12个核仁；IR组HE染色，海马CA1区锥体细胞失去正常结构，排列紊乱，细胞核皱缩，细胞数量减少，再灌注2，6，12，24，48和72 h存活锥体细胞数分别为SH组的96%，94%，90%，69%，51%和42%（P&<0.01）. SP组再灌注24，48和72 h海马CA1区存活锥体细胞数目较IR组分别增加25%，72%和116%（P&<0.01， 图1）.

　　2.2TUNEL法凋亡细胞检测
　　SH组未发现凋亡锥体细胞；IR组凋亡锥体细胞明显增加，细胞核皱缩或染色质边聚，可见凋亡小体，IR24 h凋亡细胞数目达到高峰；SP组凋亡锥体细胞较IR组明显减少，再灌注2，6，12，24，48和72 h其CA1区凋亡锥体细胞数分别仅为IR组的70%，56%，41%，35%，28%和30%（P&<0.01， 表1）. 表1大鼠脑缺血再灌注后各时点海马CA1区凋亡指数（略）
　　2.3免疫组织化学SH组XRCC1表达量较强，IR组XRCC1的表达与SH组比较有统计学差异(P&<0.01)，2 h即已开始下降，持续到72 h. SP组XRCC1表达量的降低则不明显，各时点与IR组比较均有统计学差异（P&<0.01，表2）.表2大鼠脑缺血再灌注后各时点海马CA1区XRCC1表达（略）
　　3讨论
　　ＸRCC1是参与哺乳动物DNA修复的130种蛋白之一，在碱基切除修复中起整体作用，是编码碱基损伤修复联合序列的一种重要蛋白［4］，其对一系列内外氧化剂导致的DNA单链断裂和碱基损伤修复起重要作用. 其可能通过和DNA连接酶III、DNA多聚酶β及PARP一起形成复合物而修复DNA单链断裂［5-6］. Fujimura等［7］发现，在一过性局灶脑缺血10 min，XRCC1开始衰减，持续至再灌注后24 h. 免疫组化和TUNEL双标显示失XRCC1免疫活性神经元变为TUNEL阳性，表明XRCC1早期降低先于DNA断裂的发生. 方传勤等［8］应用大鼠大脑局部缺血再灌注模型证实在脑缺血再灌注中大量DNA单链断裂和细胞调亡相关，XRCC1早期降低是DNA单链断裂无法修复的机制之一. 本试验采用大鼠全脑缺血再灌注模型，XRCC1的表达随再灌注时间呈衰减趋势，与上述结论相似.
　　JNK信号通路是MAPK家族重要成员之一，它在细胞受到胁迫性刺激而发生凋亡的过程中发挥重要的作用［9-10］. 在本实验中，JNK激酶的特异性抑制剂SP600125减轻了6 min全脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元损伤，抑制了凋亡细胞的产生. 与此同时，SP600125抑制了XRCC1在再灌注各时点的衰减. 实验数据显示，IR组各时点，XRCC1的表达与细胞凋亡数目之间有一定的相关性：XRCC1表达逐渐衰减，细胞凋亡数目呈上升趋势，在使用SP600125后，XRCC1的衰减趋得到抑制，凋亡细胞数目即随之减少. 由此推论，在大鼠全脑缺血再灌注损伤过程中，JNK信号通路与DNA修复蛋白XRCC1存有一定的联系，JNK通路的激活在直接导致细胞损伤凋亡的同时，很可能也是DNA修复功能受到损伤破坏的原因之一.
　　在临床中，脑缺血卒中、心脏骤停等疾病严重危害着人类健康，其发病过程中的具体分子机制一直是人们研究的重点，但由于脑缺血再灌注损伤过程中各种参与分子都处于一个网路系统中，相互之间的关系及作用极其复杂. 本实验初步探讨了SP600125JNK特异性抑制剂对神经元的保护性作用，其机制可能为抑制DNA修复蛋白XRCC1下调的方式维护DNA修复功能，从而减少神经元的凋亡. 但两者之间是通过何种分子机制联系起来的，还有待进一步探明.
【参考文献】
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