关于大鼠弥漫性轴索损伤后海马CA1区Apaf 1蛋白表达及其对神经元凋亡的作用

代写论文网： 【摘要】 目的：探讨大鼠弥漫性脑损伤后海马CA1区Apaf1蛋白表达及其对神经元凋亡的作用. 方法：采用Marmarou打击法制作大鼠重型闭合性颅脑损伤模型，以免疫组化技术检测海马CA1区Apaf1蛋白的表达. 结果：大鼠弥漫性脑损伤后3 h，海马CA1区Apaf1蛋白表达含量开始增加，6 h达到高峰，12 h仍保持高水平，24 h开始下降，但仍高于正常对照组. 结论：Apaf1蛋白可能参与了大鼠弥漫性脑损伤后海马CA1区的病理变化.
【关键词】 脑损伤 海马 Apaf1蛋白
　　0 引言
　　弥漫性脑损伤(diffuse brain injury， DBI)是神经外科常见的急症，海马作为脑损伤后选择易损区，伤后可出现神经元凋亡. 对脑外伤后大鼠伤侧皮质周围及海马区的细胞凋亡研究发现，该两区内细胞凋亡高峰同时出现于伤后48 h. 凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor1，Apaf1）作为调节细胞凋亡的重要因子，在线粒体介导的细胞内凋亡通路中起着至为重要的作用， Henshall等［1］也发现Apaf1/cytochrome复合体是促进caspase9引起的细胞死亡关键因素， Cao等［2］在脑缺血后的实验中提出了脑缺血后凋亡中apaf1是促进细胞继发死亡的方式，但关于其在颅脑损伤后海马CA1区表达的动态变化尚鲜见文献报道. 为此， 本研究利用Marmarou重型闭合性颅脑损伤模型， 探讨大鼠DBI后海马CA1区Apaf1表达的变化， 旨在为临床治疗颅脑创伤患者提供新的理论基础， 改善颅脑创伤患者的预后.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 选用鼠龄4 mo左右，体质量约350 g的雄性Wistar大鼠 (由中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所提供) 208只，随机分为正常对照组（12只）、假手术组（108只）和脑损伤组（108只），假手术组和脑损伤组再分为1，3，6，12，24，48，72，168，336 h共9个时相组，每组12只动物.
　　1.2 方法
　　1.2.1 DBI模型的建立 于致伤前0.5 h，经腹腔注射阿托品（30 mg/kg）. 以100 mL/L水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉动物，以750 mL/L乙醇消毒术区，沿正中矢状线切开头皮，剥离骨膜，显露冠状缝及人字缝，固定打击垫片在大鼠冠状缝与人字缝之间，将大鼠俯卧位固定于海绵床垫（10 cm×10 cm×20 cm）上. 头部固定于致伤架下，打击锤自2 m高度自由落下，打击后即刻移开大鼠，以防治打击锤造成的二次损伤. 致伤后，去除打击垫片，清创缝合伤口. 保温复苏后送回饲养. 假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合，但不致伤. 正常对照组不做任何处理.
　　1.2.2 标本采集 分别于各时相点在深度麻醉状态下开胸，以40 g/L多聚甲醛经心灌注固定1 h，断头并取脑组织标本，置于100 mL/L中性甲醛于4℃环境中后固定24 h，石蜡包埋脑组织标本. 大鼠脑组织标本冠状面连续切片，厚度5 μm，以经黏片剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱烘烤1 h后备用.
　　1.2.3 Apaf1蛋白检测 采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合法（ABC）. Apaf1免疫组化检测试剂盒由美国Santa Cruz公司提供. 石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢封闭，微波抗原修复20 min，血清封闭，滴加兔抗鼠Apaf1一抗，室温孵育60 min. 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗5 min×3次，然后滴加山羊抗兔IgG抗体－HRP多聚体，室温孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB溶液显色，镜下控制反应时间，双蒸水终止反应，脱水、透明、封片，显微镜观察. Apaf1阳性细胞为胞质成棕黄着色.
　　1.2.4 数据的收集 IOD的测量：大鼠脑损伤后的海马CA1区结构和Apaf1蛋白表达含量的变化，其中计数部分采用的是北航提供的Motic病理图像分析系统进行统计，先在图像中找到典型的阳性细胞样本，进行点选，之后图像内所有阳性细胞将都被选中，减少了人工计数的偏差.
　　统计学处理: 实验中所得计量数据均用x±s表示，经Excel数据库整理后应用Spss11.0统计软件，计量资料进行方差分析；计数资料以卡方检验分析；以双侧P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 大鼠一般情况 208只Wister大鼠月龄4～5 mo，平均月龄(4.5±0.8) mo，体质量312～391 g，平均（350±20）g. 不同组、不同时相大鼠月龄、体质量分布差异无统计学意义（P&>0.05）.
　　2.2 Marmarou DBI模型的检验 共对108只Wister大鼠行Marmarou DBI模型复制. 致伤后均出现呼吸抑制和心跳暂停，给予吸氧、人工呼吸、心脏胸廓按压等抢救措施后，有48只呼吸心跳未能恢复，于伤后1 h内死亡，存活大鼠60只，死亡率为44.4%. 各时相死亡分布如表1. 各时相大鼠死亡分布差异无统计学意义（P&>0.05）. 所有致伤大鼠伤后均出现四肢剧烈抽搐，持续15～30 s. 随后，前肢呈去皮层屈曲，昏迷状态，多于30 s内恢复心跳和自主呼吸. 存活大鼠于5～60 min内清醒，前肢恢复正常. 致伤大鼠在72 h内反应迟钝，而正常对照组和假手术组大鼠活动正常.
　　2.3 大鼠DBI后海马CA1区Apaf1蛋白表达含量的变化 脑损伤后6 h大鼠海马CA1区Apaf1阳性表达与阴性对照见图1. 正常组大鼠海马CA1区Apaf1表达水平较低. 假手术组大鼠海马CA1区Apaf1蛋白也一直保持在较低的水平的表达，两组之间差异无统计学意义(P&>0.05). Marmarou DBI后1 h组Apaf1蛋白表达水平较低. 6 h明显增强且迅速达到高峰，12 h开始下降但仍保持在较高的水平，24 h开始大幅下降，到336 h时相组一直变化平稳，但一直保持在正常表达水平之上(表2).表1 弥漫性脑损伤组各时相大鼠死亡分布表2 不同组别、不同时相大鼠海马CA1区Apaf1表达水平比较aP&<0.05 vs该组1 h时相. 3 讨论
　　关于脑外伤后继发性神经元的死亡，过去一直认为是一种细胞的坏死，Cheung 等［3］研究提出了神经元在损伤、缺血、缺氧等情况下存在细胞凋亡，并在继发性神经元的死亡中存在作用. 之后很多学者都证实这种继发的神经元的死亡，即凋亡. 1996年，得克萨斯西南医学研究中心的王晓东小组首先在Hale细胞的胞质发现Apaf1，1997年，Zou等从Hale细胞胞质内纯化和克隆出Apaf1，并证实Apaf1是凋亡体的真正核心.
　　Apaf1蛋白由3个结构域组成［4］，一个氨基末端含有半胱氨酸蛋白酶募集域CARD(caspase recruitment domain)，它可以结合caspase9前体；一个是CED4同源结构域，它可以自发产生低聚反应；羧基末端为12个重复的WD40片段，覆盖CARD和CED4同源结构域. Apaf1与细胞色素C结合后可激活caspase9，再由激活的caspase9出发级联反应，促进细胞凋亡. 正常情况下，复杂的WD40序列覆盖于CED4结构域和CARD结构域的表面，阻止caspase9前体与Apaf1的CED4同源结构域结合，当细胞色素C从线粒体内释放出后，Apaf1与细胞色素C， ATP相结合使WD40结构域移位，同时使Apaf1低聚物的CED4结构域构象发生改变，接下来Apaf1低聚物才能募集caspase9前体，从而完成线粒体途径的凋亡［5］.
　　研究已证实Apaf1［6］是调节神经元凋亡的重要因子，但关于脑损伤后Apaf1蛋白表达动态变化的报道较少，本研究结果表明，大鼠弥漫性脑损伤后3 h海马CA1区Apaf1蛋白表达开始增加IOD值达4.49±1.79，6 h明显增强迅速到高峰IOD值达31.85±7.17，12 h开始下降但仍保持在较高的水平IOD值达27.50±4.02，24 h开始大幅下降，但一直保持在正常表达水平之上. 结合以往脑损伤后1 d海马CA1区镜下可见神经元变少及细胞变形、固缩、坏死等迟发性细胞死亡的研究，证实Apaf1蛋白可能在DBI后的早期大量表达从而参与细胞的凋亡，这提示我们在颅脑损伤后早期即应通过各种治疗措施抑制Apaf1的大量表达，从而减少细胞凋亡的发生，进一步改善颅脑创伤患者的预后.

参考文献

［1］ Henshall DC， Bonislawski DP， Skradski SL， et al. Formation of the Apaf1/cytochrome c complex precedes activation of caspase9 during seizureinduced neuronal death［J］.Cell Death Differ， 2001， 8(12):1169-1181.

［2］ Cao G， Xiao M， Sun F，et al. Cloning of a novel Apaf1interacting protein: a potent suppressor of apoptosis and ischemic neuronal cell death［J］. J Neurosci， 2004， 24(27):6189-6201.

［3］ Cheung EC， MelansonDrapeau L， Cregan SP， et al. Apoptosisinducing factor is a key factor in neuronal cell death propagated by BAXdependent and BAXindepe ndent mechanisms［J］. J Neurosci， 2005， 25(6):1324-1334.

［4］ 朱 炬，王纪佐. 大鼠局灶性脑缺血后再灌注期caspase9 mRNA及Apaf1 mRNA表达的动态变化［J］.中国临床神经科学，2003，11(1):23- 26.

［5］ Yoshida H， Kong YY， Yoshida R. Apaf1 is required for mitochondrial pathways of apoptosis and brain development［J］. Cell， 1998，94(6):739-750.

［6］ Fortin A， Cregan S， MacLaurin JG. APAF1 is a key transcriptional target for p53 in the regulation of neuronal cell death［J］. J Cell Biol， 2001，155(2):207-216.