关于香烟烟雾提取物对人红细胞膜的损害作用

　　　　　　　　　　 作者：孙学敏，张献清，严向阳，杨建雄，曾成鸣

【摘要】 　　目的： 以人红细胞为模型，评估香烟烟雾提取物（CSE）对生物膜的损害作用. 方法： 以市售香烟提取CSE，然后作用于红细胞，通过测定细胞溶血率、膜脂质过氧化水平、细胞内高铁血红蛋白以及还原谷胱甘肽含量、膜磷脂组成和膜蛋白谱变化等指标，对CSE导致的红细胞膜损害进行评估. 结果： 香烟烟雾水溶物CSE可导致红细胞溶血，红细胞丙二醛和高铁血红蛋白水平升高，谷胱甘肽含量降低. 并且能够改变膜磷脂组成和诱导膜蛋白聚集. 结论： 香烟烟雾水溶物对红细胞具有氧化损害作用，这种损害作用可进一步导致红细胞丧失其正常生理功能.
【关键词】 红细胞；香烟烟雾提取物；溶血；还原谷胱甘肽；高铁血红蛋白；膜蛋白质类
　　【Abstract】AIM: To evaluate the oxidative damages of cigarette smoke extract (CSE) to human erythrocyte membrane. METHODS: The oxidative damages of erythrocyte induced by CSE were evaluated through biochemical assays of malonaldehyde (MDA)， methemoglobin (MetHb) and reduced glutathione (GSH) levels， hemolytic rate， SDSPAGE of membrane proteins and chromatographic analysis of membrane phospholipids. RESULTS: Treatment of erythrocytes with CSE induced the hemolysis and the formation of MDA and MetHb， decreased GSH level and changed the patterns of membrane proteins and phospholipids. CONCLUSION: CSE induces the oxidative damages of human erythrocytes， thus resulting in the loss of physiological functions of human erythrocytes.
　　【Keywords】 erythrocytes; cigarette smoke extract; hemolysis; reduced glutathion; methemoglobin; membrane proteins
　　0 引言
　　大量证据表明抽烟可以诱发诸多人类疾病［1］. 虽然对此已经进行了大量的研究，但对其确切的作用机制仍然不是很清楚. 在香烟烟雾对机体毒性作用中，氧化活性产物和活性氧分子造成细胞膜氧化损伤是其中的一个重要环节. 这种损伤可激活机体内的毒性化学通路，进而影响细胞的正常生理功能，导致诱变和凋亡.以红细胞为例，已有许多证据表明抽烟可以影响红细胞的生理功能［2］. 由抽烟所产生的ROS诱发的红细胞膜过氧化损伤可降低红细胞的可变形性，同时血流黏性增大，红细胞聚集性增加，并且可以改变血流成分和红细胞的流变学行为［3］.我们以人红细胞为模型，研究香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract， CSE)导致的溶血，细胞膜蛋白、脂质过氧化水平和还原谷胱甘肽含量改变，以及对膜磷脂构成的影响，以评估香烟烟雾对细胞膜的氧化损害作用，为抽烟的致病机制提供分子水平上的依据.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料BCA蛋白浓度测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，磷脂色谱标准品和电泳试剂购自Sigma公司，蛋白酶抑制剂（PMSF）购自Serva公司. 其他均为国产分析纯试剂. 3K30型冷冻离心机（美国Sigma公司）， TU1800型紫外可见分光光度计 (北京普析公司)， GDS8000凝胶成像系统(美国UVP公司)，Mini VE型垂直电泳槽(瑞典Amersham公司)， 1100LC型高效液相色谱系统（Aglient公司），QP2010型气相色谱－质谱联用仪（日本Shimadzu公司）.
　　1.2　方法
　　1.2.1　红细胞分离
　　健康人新鲜全血由陕西省西安市红十字血液中心提供. 分离时，取新鲜全血10 mL，在4℃， 750 g条件下离心10 min，用玻璃吸管小心地吸去血浆和沉积红细胞表面的一层白色膜状物，得到的红细胞用预冷的等渗磷酸盐缓冲液（PBS:138 mmol/L NaCl， 6.1 mmol/L Na2HPO4， 1.4 mmol/L NaHPO4， pH 7.4）洗涤后再离心.重复3次，然后与PBS配制成一定浓度的红细胞悬液备用.
　　1.2.2　香烟烟雾提取物CSE的制备
　　点燃香烟（市售，焦油含量15 mg/支），用50 mL注射器手工抽取烟雾，香烟燃烧速度约为1 min/支，迅速注入PBS溶液中（1 mL/支），经0.22 μm微孔滤膜过滤后立即使用.
　　1.2.3　生化指标分析
　　用CSE溶液与红细胞悬液混合， 37℃孵育40 min，然后用冷的等渗溶液洗涤，并稀释至所需浓度（脂质过氧化指标采用30 mL/L红细胞悬液，其他指标采用的红细胞浓度均为33 mL/L）.
　　红细胞溶血测定：将经过CSE处理过的红细胞加入到等渗溶液中. 室温孵育30 min后，离心取上层液， 540 nm下测定A值，以等渗溶液为空白对照，低渗条件下红细胞完全溶血的吸收值为100%，计算红细胞的溶血率.
　　根据文献［4］的方法测定还原谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）和高铁血红蛋白（methemoglobin，MetHb）的含量; 膜脂质过氧化产物丙二醛（malonaldehyde， MDA）含量测定采用文献［5］的方法.
　　1.2.4　红细胞膜蛋白电泳取经过CSE处理的红细胞悬液，按1/30的体积比与预冷的低渗磷酸盐缓冲液（5 mmol/L Na2HPO4， 0.1 mmol/L 蛋白酶抑制剂PMSF， pH 8.0）混合，4 ℃恒温水浴中溶血1 h. 然后在4℃， 19 800 g条件下离心20 min，弃去上清后用低渗磷酸盐缓冲液洗涤两次（4℃， 32 000 g， 20 min），即可得到乳白色的红细胞膜样品. 用BCA试剂盒定量膜蛋白，将样品最终稀释至1 g/L. 进行电泳时，将红细胞膜样品与2×样品缓冲液（100 mmol/L Tris/HCl， 41.7 g/L SDS， 200 mL/L甘油， 10 g/L溴酚蓝）混合，50 ℃恒温水浴中加热1 h，离心后用微量注射器将样品加入样品孔中. 接通电源，在50 g/L浓缩胶和100 g/L分离胶中进行非连续SDSPAGE电泳. 采用考马斯亮蓝R250染色，脱色后照相保存.
　　1.2.5　红细胞膜脂类的提取和分析
　　在红细胞膜样品中加入2倍体积的甲醇，摇匀，随后加入4倍体积的氯仿，4 ℃静置2 h. 取上清，加入三蒸水，摇匀. 下层加入2倍体积的混合液（氯仿∶甲醇∶水＝ 3∶48∶47）.静置过夜，合并有机相，氮气吹干. 在提取过程中， 每步均加入二羟基丁基甲苯，总浓度为5 g/L. 然后用高效液相色谱（HPLC）分析膜磷脂，色谱柱为DIKMA 公司SILICA柱（250.0 mm ×4.6 mm， 5 μm）;柱温室温，流动相： 乙腈∶甲醇∶磷酸（850 mL/L）= 160∶10∶1，流速为0.8 mL/min，检测波长为206 nm. 以磷脂标准品为对照，积分求得各峰面积后，计算样品中各磷脂组分含量.
　　统计学处理： 除特别说明外，所有数据均表示为x±s，用SPSS10.0统计软件进行处理.组间比较采用方差分析及t检验.
　　2　结果
　　2.1　CSE诱导红细胞溶血的作用
　　红细胞溶血是CSE诱导细胞膜损害最直接的表象. 如图1所示，低浓度的CSE即可导致红细胞溶血，并随CSE浓度增加溶血作用增强，在400 mL/L CSE时达到最大值62.6%.当CSE浓度继续增大时，溶血率有所降低，这是由于高浓度的CSE可导致高铁血红蛋白增加，使血红蛋白(Hb)的最大吸收波长发生变化，吸收值下降.此外，高浓度的CSE还可导致血红蛋白分子聚集，并与膜蛋白发生交联，也可造成血红蛋白的吸收值下降.
　　2.2　CSE对红细胞膜脂质过氧化的影响
　　细胞膜脂质在氧化胁迫下会产生过氧化作用，主要产物为MDA. MDA与硫代巴比妥酸反应后，在532 nm处有一特征吸收峰，由此可对膜脂质过氧化水平进行定量分析.经CSE处理后，红细胞的MDA水平升高，特别是在CSE浓度高于300 mL/L时，上升趋势较为明显. 结果表明，高浓度的CSE可加速红细胞膜的脂质过氧化(图1).
　　2.3　CSE对红细胞GSH和MetHb含量的影响
　　CSE与RBC共同孵育后， GSH的含量明显下降（表1），但增大CSE浓度（100~300 mL/L范围内）对GSH含量的影响不大. 这一结果表明CSE在一定程度上降低了红细胞的抗氧化能力.表1CSE对红细胞高铁血红蛋白和谷胱甘肽含量的影响(略)

　CSE中的氧化性物质可使Hb中的Fe2+ 转变为Fe3+.如表1所示，经CSE处理后，红细胞内的MetHb含量增加， 100 mL/L CSE可导致MetHb的含量增加7倍以上.
　　2.4　香烟焦油对红细胞膜蛋白的影响
　　红细胞在经CSE处理后，其膜蛋白的SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳图谱发生明显改变. 如图2所示，与空白对照比较，高浓度的CSE（300 mL/L）可以导致一些膜蛋白聚集，生成高分子量聚集体，这些高分子量聚集体主要来源于带2.3，带3，带4.3和带5蛋白，从图谱上可以看出这些蛋白条带（由箭头标示）均有不同程度减弱甚至消失. CSE处理的膜蛋白经DTT还原后，电泳条带中无高分子量聚集体出现.
　　2.5　红细胞膜磷脂的高效液相色谱分析
　　经CSE作用后，红细胞膜中最主要的两种磷脂PE和PC在CSE的作用下分析值降低.在206 nm处检测色谱分离的膜磷脂时，其信号主要与磷脂分子中不饱和脂肪酸双键的含量有关，所以， PE和PC的分析值下降反映了膜磷脂分子中不饱和脂肪酸的含量减少. 另外，CSE中的一些组分导致磷脂分子脂肪酸链水解也可能是细胞膜中磷脂含量减少的原因之一(图3).
　　3　讨论
　　已知香烟烟雾中的物质可达4000多种，其中不乏具有生物毒性的气体和颗粒物质. 这些毒性物质包括半醌自由基、氮氧化合物、由过氧化氢以及羟基自由基产生的超氧化合物等［6］，它们可激活体内活性氧(ROS)及其他毒性化学通路，导致细胞基因突变，诱发心血管疾病及其他慢性疾病［7-8］.
　　香烟烟雾可分为气相和焦油相，两者中除了含有大量的氧化性物质和自由基外，还含有少量具有催化氧化作用的离子化合物. 这些物质在体内导致氧化胁迫进而诱导细胞的氧化损害. 红细胞是机体血液循环系统中数量最多的有形成分，具有携带氧、清除自由基、维持血流及电解质平衡等功能，其抗氧化能力强弱与整个机体的抗氧化能力密切相关，同时也是一种最易遭受自由基损伤的细胞.
　　本研究我们采用研究CSE对红细胞的损害作用，结果表明，CSE具有溶血作用，同时伴随细胞脂质过氧化水平和MetHb含量升高，GSH含量降低. CSE对细胞膜的作用导致膜磷脂组成改变并诱导膜蛋白，特别是骨架蛋白的聚集. 这些变化均与CSE的氧化损害作用密切相关. 当这种作用积累到一定程度时，就可能导致机体的不可逆损害. 有报道［9］称吸烟者需要摄入更多的维生素A和E，说明香烟烟雾增加了体内还原性物质的消耗，以降低其氧化损害作用.
　　GSH在红细胞内的一个重要作用是消除低水平过氧化物的毒性，还原被氧化的细胞膜和细胞内蛋白中的巯基，因而在维持红细胞的正常结构和功能方面具有重要的作用. CSE消耗了红细胞中大量的GSH，降低了对细胞的保护作用，使得细胞内的其他物质更易于受到氧化攻击. 这种攻击的一个直接结果就是将Hb分子中的铁从还原型的二价亚铁（Fe2+）转变为三价铁（Fe3+）. 正常人的Hb分子中的铁99％以上为Fe2+，仅少量Hb分子含有Fe3+，为MetHb. 如果血液中MetHb的含量超过总量的10％时，即成为高铁血红蛋白症. 高铁血红蛋白血症时可有红细胞载氧能力降低、Hb轻度减少，红细胞形态异常等现象.
　　 红细胞的正常生理功能与细胞膜结构的完整性密切有关，其中膜脂质和膜蛋白的组成和结构变化均会对膜的通透性、变形性、物质运输、细胞识别以及酶的活性产生影响. 在本实验中，红细胞经CSE处理后，一些膜蛋白产生聚集，两种主要的膜磷脂，PC和PE的含量降低，这些必然会导致细胞膜的结构和功能改变. SDSPAGE结果表明高分子量蛋白聚集部分主要来源于细胞膜的骨架蛋白，这些蛋白的聚集与CSE诱导的蛋白质分子氧化和二硫键重组，进而引起蛋白肽链交联相关.
　　综上所述，CSE对细胞的损害主要源于其中的氧化性物质和自由基. 红细胞在CSE的作用下，抗氧化能力降低，细胞膜的性质发生改变. 这些变化将影响整个机体的抗氧化能力.

参考文献

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