关于线粒体ATP敏感性钾离子通道参与远程预处理对大鼠脑保护作用的机制

　　　　　　　　 作者：赵翚，董海龙，熊利泽，路志红，孙静，徐宁

【摘要】 　　目的： 探讨线粒体ATP敏感性钾离子通道在远程预处理对大鼠脑保护效应中的作用. 方法： SD雄性大鼠，随机分为4组（每组n=10）： ① RPC+NS组，行远程预处理前15 min，给予生理盐水1 mL静脉注射，远程预处理1 h后行MCAO；② RPC+5HD组，行远程预处理前15 min给予5羟基葵酸盐（5HD）10 mg/kg静脉注射，远程预处理后1 h行MCAO；③ DIAZ组，MCAO前30 min给予二氮嗪（DIAZ）5 mg/kg腹腔注射；④ DMSO组，MCAO前30 min给予5 g/L DMSO. 所有大鼠行MCAO模型阻闭120 min恢复再灌注，观察再灌注后24 h时神经功能损害并取大脑行TTC染色测量脑梗死容积百分比. 结果： ① 神经功能障碍评分：再灌注24 h后神经功能障碍评分，RPC+NS组和DIAZ组与RPC+5HD组和DMSO组相比有统计学差异（P&<0.05 ），RPC+5HD组和DMSO组 相比无统计学差异（P&>0.05）. ② 脑梗死容积百分比： 再灌注24 h后脑梗死容积百分比RPC+NS组［（16.3±2.9）%， P=0.00］和DIAZ组［（17.5±8.9）%， P=0.00］明显小于RPC+5HD组（46.1±10.1）%和DMSO 组（36.4±10.9）%，而DMSO 组和RPC+5HD组相比较无统计学差异（P=0.216），RPC+NS组和DIAZ组相比较无统计学差异（P=0.747）. 结论： 线粒体敏感性钾离子通道阻断剂可阻断远程预处理保护作用，提示线粒体敏感性钾离子通道参与远程预处理对大鼠脑缺血耐受的形成机制.
【关键词】 远程预处理；线粒体敏感性钾离子通道；脑缺血；再灌注
　　【Abstract】 AIM: To investigate　whether the neuroprotection effect of remote preconditioning(RPC) is dependent on mitochondrial adenosine triphosphate （ATP）sensitive potassium channel in transient focal cerebral ischemiareperfusion model in rats. METHODS: Forty male SD rats weighing (300±20) g were randomly allocated to 4 groups (n=10). RPC+NS group: the rats were intravenously injected with 1 mL saline 15 min before RPC and middle cerebral artery occlusion (MCAO) was performed 1 h after RPC; RPC+5HD group: the rats were intravenously injected with 5HD(10 mg/kg) 15 min before RPC and MCAO was performed 1 h after RPC; DIAZ Group: 30 min before MCAO， the rats were intraperitoneally administered with diazoxide(DIAZ 5 mg/kg) 30 min before MCAO without RPC; DMSO group: the rats were intraperitoneally administered with 5 g/L dimethyl sulfoxide (DMSO) 30 min before MCAO. MCAO was induced by occluding the right middle cerebral artery for 120 min. Neuroligical deficit score(NDS)and brain infarct volume were evaluated at 24 h after reperfusion. RESULTS: ① The NDS in RPC+NS and DIAZ group were better than those in RPC+5HD group and DMSO group （P&<0.05 ）. There was no significant difference in NDS between RPC+5HD group and DMSO group （P&>0.05）. ② The infarct volume percentage in RPC+NS （16.3±2.9）% and DIAZ （17.5±8.9）% group were significantly lower than those in RPC+5HD （46.1±10.1）% and DMSO （36.4±10.9）% group (P&<0.01). There was no statistical difference in the infarct volume percentage between DMSO group RPC+5HD group (P=0.216) and between DIAZ group and RPC+NS group (P=0.747). CONCLUSION： The blocking of mitochondrial ATPsensitive potassium channel can abolish the neuroprotective effect induced by RPC in rat. It suggests that ischemic tolerance induced by RPC is dependent on the activation of mitochondrial ATPsensitive potassium channel.
　　【Keywords】 remote preconditioning; mitochondrial ATPsensitive potassium channel; brain ischemia; reperfusion
　　0 引言
　　
　　我们以前的研究已证实远程预处理对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用［1］，可诱导缺血耐受，但远程预处理对脑缺血/再灌注损伤保护机制尚不清楚. 我们在研究中发现，吸入性麻醉药预处理诱导脑缺血耐受机制中有线粒体敏感性钾离子通道的参与［2］. 为证实在远程预处理诱导脑缺血耐受的机制中是否同样有线粒体敏感性钾离子通道的参与，我们进行了此项研究. 本实验我们通过远程预处理（RPC）前，给予线粒体敏感性钾离子通道阻断剂，利用大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，观察其对RPC诱导的脑缺血耐受的影响，对远程预处理脑保护机制作初步探讨.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　雄性SD大鼠，体质量（300±20）g，随机分为4组（每组n=10）：① RPC+NS组，行远程预处理前15 min，给予生理盐水1 mL静脉注射，远程预处理1 h后行MCAO；② RPC+5HD组，行远程预处理前15 min给予5HD 10 mg/kg静脉注射，远程预处理1 h后行MCAO；③ 二氮嗪（DIAZ）组，MCAO前30 min给予DIAZ 5 mg/kg腹腔注射；④ DMSO组，MCAO前30 min给予5 g/L DMSO. 所有大鼠行MCAO模型阻闭120 min恢复再灌注，观察再灌注后24 h时神经功能损害并取大脑行TTC染色测量脑梗死容积百分比.
　　1.2　方法
　　1.2.1　远程预处理用10 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉（40 mg/kg）后，将大鼠仰卧位固定，在双侧后肢股三角处消毒沿血管走行横行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉用无损伤动脉夹夹闭股动脉5 min造成肢体缺血，松开血管夹再灌注5 min，重复3次.
　　1.2.2　大鼠局灶性脑缺血模型动物术前禁食12 h，自由饮水. MCAO模型根据Koizumi所描述的方法［3］行右侧颈内动脉尼龙线线栓法：即动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线（30，ETHICON，日本）置入颈内动脉约17~18 mm，直到有轻微阻力感为止. 阻闭120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注. 实验期间用烤灯维持体温于 37.0℃~37.5℃.
　　1.2.3　神经功能障碍评分动物苏醒后，放回鼠笼，自由饮食. 脑缺血再灌注后24 h，由一不了解分组情况的观察者评估记录神经功能障碍评分. 评分标准采用 6级评分法［4］：0级，无功能障碍；1级，不能伸展左侧前肢；2级，向左侧旋转；3级，向左侧倾倒；4级，无自主活动伴意识抑制；5级，死亡.
　　1.2.4脑梗死容积测量完成神经功能障碍评分后，经腹腔注射氯胺酮深麻醉后断头处死动物，迅速取出鼠脑，置于冰盐水10 min，取冠状面均匀切成2 mm厚脑片，迅速放入20 g/L的2，3，5氯化三苯四唑（TTC）溶液（37℃）中染色30 min，然后用40 g/L甲醛缓冲液固定. 24 h后用数码相机（KODAK， DC240， 美国）拍照，输入计算机，用图像处理软件（ADOBE， PHOTOSHOP7.0）计算梗死容积（粉红色区为正常脑组织，白色为脑梗死区）百分比，即梗死灶占对侧正常大脑半球的百分比.
　　统计学处理： 统计资料采用SPSS 12.0统计软件进行分析处理，脑梗死容积及梗死百分比用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA)及两两比较；神经功能学评分用中位数表示，组间比较用KruskalWallis秩和检验，两两比较采用MannWhitney U检验，P&<0.05表示差异有统计学意义.
　　2　结果
　　2.1　神经功能障碍评分再灌注24 h后神经功能障碍评分，RPC+NS组和DIAZ组与RPC+5HD和DMSO组相比有统计学差异（P&<0.05 ），RPC+5HD和DMSO组相比无统计学差异（P&>0.05，表1）. 表1大鼠缺血再灌注24 h后神经功能障碍评分 （略）
　　2.2　脑梗死容积百分比再灌注24 h后脑梗死容积百分比RPC+NS组［(16.3±2.9)%， P=0.00］和DIAZ组［（17.5±8.9)%， P=0.00］明显小于RPC+5HD组（46.1±10.1)%和（36.4±10.9)%，而DMSO组和RPC+5HD组相比较无统计学差异（P=0.216），RPC+NS组和DIAZ组相比较无统计学差异（P=0.747） .
　　3　讨论
　　 本实验我们应用MCAO模型发现远程预处理和线粒体敏感性钾离子通道开放剂均对脑缺血/再灌注损伤具有一定的保护作用，而给予线粒体敏感性钾离子通道阻断剂后，远程预处理对大鼠脑的保护作用被阻断.
　　 线粒体敏感性钾离子通道由Inoue等［5］1991年在小鼠肝脏细胞中发现. 在随后开展的实验中，学者发现线粒体敏感性钾离子通道与心脑抗缺血保护作用密切相关. Miura等［6］用线立体敏感性钾离子通道开放剂DIAZ预处理离体兔心，随后进行30 min全心缺血和24 h再灌注，预处理组心肌梗死灶均比未处理组显著缩小，且DIAZ的保护作用可被 5HD抑制. Goodman 等［7］在神经细胞中发现了类似现象 ，在给予线粒体 ATP敏感性钾通道开放剂DIAZ后 ，海马神经元在氧化伤害条件下的存活率明显上升. 上述文献说明线粒体敏感性钾离子通道在心脑细胞的保护中具有重要作用 ，线粒体敏感性钾离子通道活动的调控是研究缺血脑保护的重要环节. 我们以往的研究中也证实线粒体ATP敏感性钾离子通道的激活是吸入性麻醉剂Isoflurane预处理诱导脑缺血耐受的重要机制之一，应用线粒体ATP敏感性钾离子通道阻断剂glibenclamide（GLB）可抑制Isoflurane预处理诱导脑缺血耐受［2］.
　　远程预处理对脑缺血/再灌注损伤具有保护机制是否也与线粒体敏感性钾离子通道有关. 本实验结果提示，在行远程预处理前给予线粒体敏感性钾离子通道阻断剂5HD，远程预处理1 h后行MCAO，该组脑梗死容积百分比明显大于远程预处理组和DIAZ组. 线粒体敏感性钾离子通道被阻断后，远程预处理对脑缺血/再灌注损伤保护作用也随之消失. 实验说明远程预处理对脑缺血/再灌注损伤的保护作用，是与线粒体敏感性钾离子通道开放有关. 当线粒体敏感性钾离子通道开放时，线粒体膜电位低、去极化，线粒体呼吸作用增强以及线粒体基质体积增大［8］. 这可能会产生下述几个作用： ① 调节线体Ca2+浓度，降低膜电位抑制Ca2+内流从而有效防止线粒体内钙超载［9］；② 膜电位降低与粒体呼吸作用增强可以减少氧自基的产生［10］ ；③ 线粒体膜电位的变化有助于缺血时糖酵途径向有利于细胞存活的方向转变［10］；④ 线粒体基质体积对其能量生成的调节有重要作用［11］. 远程预处理可能诱发线粒体ATP敏感性钾离子通道的开放，从而调节线粒体对继发缺血所产生的损害产生耐受，达到保护效应.
　　 综上所述，本实验表明线粒体敏感性钾离子通道参与远程预处理对脑缺血/再灌注损伤缺血耐受的产生，但其具体的作用机制还有待于作进一步的研究.

参考文献

　　我们以前的研究已证实远程预处理对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用［1］，可诱导缺血耐受，但远程预处理对脑缺血/再灌注损伤保护机制尚不清楚. 我们在研究中发现，吸入性麻醉药预处理诱导脑缺血耐受机制中有线粒体敏感性钾离子通道的参与［2］. 为证实在远程预处理诱导脑缺血耐受的机制中是否同样有线粒体敏感性钾离子通道的参与，我们进行了此项研究. 本实验我们通过远程预处理（RPC）前，给予线粒体敏感性钾离子通道阻断剂，利用大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，观察其对RPC诱导的脑缺血耐受的影响，对远程预处理脑保护机制作初步探讨.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性SD大鼠，体质量（300±20）g，随机分为4组（每组n=10）：① RPC+NS组，行远程预处理前15 min，给予生理盐水1 mL静脉注射，远程预处理1 h后行MCAO；② RPC+5HD组，行远程预处理前15 min给予5HD 10 mg/kg静脉注射，远程预处理1 h后行MCAO；③ 二氮嗪（DIAZ）组，MCAO前30 min给予DIAZ 5 mg/kg腹腔注射；④ DMSO组，MCAO前30 min给予5 g/L DMSO. 所有大鼠行MCAO模型阻闭120 min恢复再灌注，观察再灌注后24 h时神经功能损害并取大脑行TTC染色测量脑梗死容积百分比.

　　1.2方法

　　1.2.1远程预处理用10 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉（40 mg/kg）后，将大鼠仰卧位固定，在双侧后肢股三角处消毒沿血管走行横行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉用无损伤动脉夹夹闭股动脉5 min造成肢体缺血，松开血管夹再灌注5 min，重复3次.

　　1.2.2大鼠局灶性脑缺血模型动物术前禁食12 h，自由饮水. MCAO模型根据Koizumi所描述的方法［3］行右侧颈内动脉尼龙线线栓法：即动物麻醉后取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用乙醇灯烧成圆头的尼龙线（30，ETHICON，日本）置入颈内动脉约17~18 mm，直到有轻微阻力感为止. 阻闭120 min后抽出尼龙线，恢复再灌注. 实验期间用烤灯维持体温于 37.0℃~37.5℃.

　　1.2.3神经功能障碍评分动物苏醒后，放回鼠笼，自由饮食. 脑缺血再灌注后24 h，由一不了解分组情况的观察者评估记录神经功能障碍评分. 评分标准采用 6级评分法［4］：0级，无功能障碍；1级，不能伸展左侧前肢；2级，向左侧旋转；3级，向左侧倾倒；4级，无自主活动伴意识抑制；5级，死亡.

　　1.2.4脑梗死容积测量完成神经功能障碍评分后，经腹腔注射氯胺酮深麻醉后断头处死动物，迅速取出鼠脑，置于冰盐水10 min，取冠状面均匀切成2 mm厚脑片，迅速放入20 g/L的2，3，5氯化三苯四唑（TTC）溶液（37℃）中染色30 min，然后用40 g/L甲醛缓冲液固定. 24 h后用数码相机（KODAK， DC240， 美国）拍照，输入计算机，用图像处理软件（ADOBE， PHOTOSHOP7.0）计算梗死容积（粉红色区为正常脑组织，白色为脑梗死区）百分比，即梗死灶占对侧正常大脑半球的百分比.

　　统计学处理： 统计资料采用SPSS 12.0统计软件进行分析处理，脑梗死容积及梗死百分比用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA)及两两比较；神经功能学评分用中位数表示，组间比较用KruskalWallis秩和检验，两两比较采用MannWhitney U检验，P&<0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1神经功能障碍评分再灌注24 h后神经功能障碍评分，RPC+NS组和DIAZ组与RPC+5HD和DMSO组相比有统计学差异（P&<0.05 ），RPC+5HD和DMSO组相比无统计学差异（P&>0.05，表1）. 表1大鼠缺血再灌注24 h后神经功能障碍评分 （略）

　　2.2脑梗死容积百分比再灌注24 h后脑梗死容积百分比RPC+NS组［(16.3±2.9)%， P=0.00］和DIAZ组［（17.5±8.9)%， P=0.00］明显小于RPC+5HD组（46.1±10.1)%和（36.4±10.9)%，而DMSO组和RPC+5HD组相比较无统计学差异（P=0.216），RPC+NS组和DIAZ组相比较无统计学差异（P=0.747） .

　　3讨论

本实验我们应用MCAO模型发现远程预处理和线粒体敏感性钾离子通道开放剂均对脑缺血/再灌注损伤具有一定的保护作用，而给予线粒体敏感性钾离子通道阻断剂后，远程预处理对大鼠脑的保护作用被阻断.

线粒体敏感性钾离子通道由Inoue等［5］1991年在小鼠肝脏细胞中发现. 在随后开展的实验中，学者发现线粒体敏感性钾离子通道与心脑抗缺血保护作用密切相关. Miura等［6］用线立体敏感性钾离子通道开放剂DIAZ预处理离体兔心，随后进行30 min全心缺血和24 h再灌注，预处理组心肌梗死灶均比未处理组显著缩小，且DIAZ的保护作用可被 5HD抑制. Goodman 等［7］在神经细胞中发现了类似现象 ，在给予线粒体 ATP敏感性钾通道开放剂DIAZ后 ，海马神经元在氧化伤害条件下的存活率明显上升. 上述文献说明线粒体敏感性钾离子通道在心脑细胞的保护中具有重要作用 ，线粒体敏感性钾离子通道活动的调控是研究缺血脑保护的重要环节. 我们以往的研究中也证实线粒体ATP敏感性钾离子通道的激活是吸入性麻醉剂Isoflurane预处理诱导脑缺血耐受的重要机制之一，应用线粒体ATP敏感性钾离子通道阻断剂glibenclamide（GLB）可抑制Isoflurane预处理诱导脑缺血耐受［2］.

　　远程预处理对脑缺血/再灌注损伤具有保护机制是否也与线粒体敏感性钾离子通道有关. 本实验结果提示，在行远程预处理前给予线粒体敏感性钾离子通道阻断剂5HD，远程预处理1 h后行MCAO，该组脑梗死容积百分比明显大于远程预处理组和DIAZ组. 线粒体敏感性钾离子通道被阻断后，远程预处理对脑缺血/再灌注损伤保护作用也随之消失. 实验说明远程预处理对脑缺血/再灌注损伤的保护作用，是与线粒体敏感性钾离子通道开放有关. 当线粒体敏感性钾离子通道开放时，线粒体膜电位低、去极化，线粒体呼吸作用增强以及线粒体基质体积增大［8］. 这可能会产生下述几个作用： ① 调节线体Ca2+浓度，降低膜电位抑制Ca2+内流从而有效防止线粒体内钙超载［9］；② 膜电位降低与粒体呼吸作用增强可以减少氧自基的产生［10］ ；③ 线粒体膜电位的变化有助于缺血时糖酵途径向有利于细胞存活的方向转变［10］；④ 线粒体基质体积对其能量生成的调节有重要作用［11］. 远程预处理可能诱发线粒体ATP敏感性钾离子通道的开放，从而调节线粒体对继发缺血所产生的损害产生耐受，达到保护效应.

综上所述，本实验表明线粒体敏感性钾离子通道参与远程预处理对脑缺血/再灌注损伤缺血耐受的产生，但其具体的作用机制还有待于作进一步的研究.