关于辛伐他汀对心肌梗死大鼠心功能、心肌肌球蛋白重链与肌动蛋白的影响

　　　　　　　　 作者：张冬颖，覃数，唐显军，杨辉，陈泓颖

【摘要】 　　目的： 探讨3羟基3甲基戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制剂辛伐他汀对心肌梗死后心肌细胞内α肌球蛋白重链（αMHC）， β肌球蛋白重链（βMHC）及骨骼肌α肌动蛋白（Sk αactin）表达的影响. 方法： 结扎Wistar大鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型，24 h后存活大鼠随机分为心肌梗死组（MI组）、辛伐他汀（Sim）20 mg组和40 mg组，另设假手术组（SH组）. Sim 组分别予20 mg/kg·d和40 mg/kg·d灌胃，MI组和Sham组以等量等浓度溶剂灌胃. 8 wk后检测各组血流动力学指标，RTPCR检测大鼠非梗死区心肌αMHC和βMHC mRNA表达，免疫组化法测定Sk αactin表达. 结果： MI组左室舒张末压高于SH组，左室收缩压低于SH组；两个Sim组左室舒张末压低于MI组，左室收缩压高于MI组. MI组αMHC mRNA表达低于SH组，βMHC mRNA表达高于SH组（均P&<0.01）；两个 Sim组αMHC mRNA表达均高于MI组，βMHC mRNA表达低于MI组（P&<0.01）. Sk αactin在SH组表达少，MI组表达明显增多，在两个Sim组中表达少于MI组. 两个Sim组间无统计学差异. 结论： 辛伐他汀能减少心肌梗死后非梗死区心肌细胞内αMHC基因mRNA表达，增加βMHC基因mRNA表达，减少Sk αactin表达，抑制心肌肥大，改进心脏功能.
【关键词】 心肌梗塞；肌球蛋白类；肌动蛋白类；斯伐他汀
　　【Abstract】 AIM: To assess the effects of Hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor simvastatin (Sim) on cardiac function， cardiomyosin heavy chain（MHC） and actin expression in rats with myocardial infarction. METHODS: The myocardial infarction (MI) models were induced by ligation of anterior descending coronary artery in Wistar rats. Twentyfour hours later， the survivals were randomly pided into 3 groups: MI group， 20 mg Sim group and 40 mg Sim group， the rats with sham ligation formed into sham group. The rats in the two Sim groups received intragastric administration of Sim 20 and 40 mg/kg·d. Respectively for 8 weeks. The rats in MI group and sham group were treated with the same quantity of solvent as placebo. After 8 weeks， the hemodynamic parameters were examined. The α and β MHC mRNA expressions in noninfarcted zone were detected by RTPCR. The skelecton αactin (Sk αactin) expression was detected by immunohistochemistry. RESULTS: Compared with sham group， in MI group， left ventricular enddiastolic pressure (LVEDP) was increased and left ventricular systolic pressure (LVSP) was depressed significantly. Compared with MI group， LVEDP was depressed and LVSP was increased in the two Sim groups. The αMHC mRNA expression was lower and the β MHC mRNA expression was higher in MI group than in Sham group. Compared with MI group， the α MHC mRNA expression was enhanced and the β MHC mRNA expression was lessened in both Sim groups. The expression of Sk αactin was weak in sham group and strong in MI group， and the expression decreased in both Sim groups. CONCLUSION: Simvastatin attenuates the mRNA expression of αMHC and enhances βMHC mRNA expression. It also decreases the Sk αactin expression in rats after MI. It may play some roles in the restraint of cardiac hypertrophy and the improvement of myocardial remodeling.
　　【Keywords】 myocardial infarction; myosins; actins; simvastatin
　　0 引言
　　心肌肥大是心肌梗死（myocardial infarction， MI）后心室重塑的主要表现，始于MI后早期，贯穿于心室重塑全程，使心脏逐渐发展为心力衰竭. 有研究表明，“胚胎基因”（fetal genes）的重启和心肌细胞蛋白表型改变在心肌细胞肥大过程中发挥重要的作用［1］. 离体实验表明，他汀类药物（statins）能阻断AngII， NA， ET1等刺激因子诱导的成体或胎心细胞肥大［2］. Statins能否在体内抑制心肌肥大、延缓心力衰竭发生，报道较少，其机制更不清楚. 我们的前期实验已提示辛伐他汀（Sim）具有改善MI后心功能作用［3］，本研究旨在观察Sim对MI后心肌细胞内α， β肌球蛋白(α， βMHC)及骨骼肌α肌动蛋白(Sk αactin)表达的影响，探讨他汀类逆转心室重塑的机制.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　Wistar雄性大鼠，体质量185~225 g，第三军医大学附属大坪医院实验动物中心提供；RTPCR引物由北京华大中生科技发展有限公司合成；AMV逆转录酶（日本TaKaRa）；Taq plus DNA聚合酶（日本TaKaRa）；Tru9I 限制性内切酶（美国Promega）；兔抗大鼠骨骼肌 αActin mAb（美国Santa Cruz）；生物素标记羊抗兔IgG和免疫组化ABC试剂盒（武汉博士德公司）；辛伐他汀（批号N1001， 杭州默沙东制药有限公司），戊巴比妥钠（美国Sigma）、琼脂糖（美国Promega）、多聚甲醛、羧甲基纤维素钠及其他常用试剂购自北京北方同正生物试剂有限公司.
　　1.2　方法
　　1.2.1　动物模型建立与分组
　　按Pfeffer等［4］方法结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型，在相同部位只穿线不结扎，为假手术组(n=8). 术后24 h存活大鼠随机分为3组：心肌梗死组（MI组，n=10）；辛伐他汀20 mg组（20 mg Sim组，20 mg/kg·d，n=10）；辛伐他汀40 mg组（40 mg Sim组，40 mg/kg·d，n=10）. Sim组均于术后第3日起灌胃给药，连续8 wk；MI组和Sham组每日以等量等浓度溶剂20 mL/L羧甲基纤维素钠灌胃，连续8 wk.
　　1.2.2　血流动力学测定
　　25 g/L戊巴比妥钠35 mg/kg腹腔注射行全身麻醉，分离右颈总动脉和左股动脉，经右颈总动脉插入聚苯乙烯PE20导管至左心室，导管另一端经能量转换器连接MPA2000多导生理记录仪，测定左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室压力变化最大上升和下降速率（±dp/dtmax），同时经股动脉插管同步记录动脉收缩压（BPs）和动脉舒张压（BPd）.
　　1.2.3　心脏形态学检测和标本
　　留置经股静脉注入100 mL/L氯化钾 2 mL处死大鼠，分离左、右心室，分别称取左、右心室质量（LVW， RVW），计算左、右心室质量与体质量（BW）之比，即为左、右心室质量指数（LVWI， RVWI， mg/g）. 称质量后于左室冠状面梗死区中部切取厚约3 mm左室截面，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度3~4 μm，HE染色后观察心肌组织结构. 按Taylor等［5］的方法用Image Pro Plus 4.0图像分析系统计算心肌梗死面积. 梗死面积(%) ﹦瘢痕组织弧长/［(左室截面外周长+左室截面内周长) /2］×100%. 剩余心肌按梗死区和非梗死区分开，留取非梗死区心肌50~100 mg，液氮冷冻48 h后存于-70℃冰箱.
　　1.2.4　RTPCR检测αMHC和βMHC mRNA表达
　　① 引物： 北京华大中生科技发展有限公司合成. α MHC和βMHC cDNA具有高达96 %的同源性，采用同一引物扩增，扩增长度310 bp. 上游引物序列为：5′GCA GAC CAT CAA GGA CCT′3′；下游引物序列为：5′GTT GGC CTG TTC CTC CGC C3′. βactin引物上游序列为：5′TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG3′；下游引物序列为：5′ GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG3′，扩增长度764 bp. ② 反应体系和反应步骤：苯酚/氯仿法提取心肌组织总RNA，AMV逆转录酶( TaKaRa )逆转录cDNA， PCR反应由Taq plus DNA 聚合酶（TaKaRa）催化. PCR反应体系包含cDNA 2 μmol/L和dNTP 2 μmol/L， 10×Buffer 3 μmol/L， Taq酶(TaKaRa) 0.2 μmol/L， Mgcl2 2 μmol/L，上/下游引物各0.3 μmol/L (5 pmol/L)，加去离子水22.2 μmol/L至总量30.0 μmol/L. 94℃解链2 min， 94℃变性30 s， 59℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 38个循环；末次循环后72℃ 延伸5 min，内参βactin反应体系及条件与所测指标相同. ③ 结果分析：反应结束后，参照Barbato等［6］方法，将PCR扩增产物稀释到60 μmol/L，加50单位Tru9I 限制性内切酶37℃消化120 min，得到 αMHC（310 bp）和 βMHC（257 bp + 53 bp）的混合产物，混合产物与βactin同时在40 g/L琼脂糖凝胶中电泳，用Quantity One 4.40 图像分析系统进行图像扫描和分析，分别计算αMHC/βactin， βMHC/βactin A值，代表其相对表达量.
　　1.2.5　SABC免疫组化法检测
　　Sk αactin表达石腊切片（3 μm）常规脱蜡、水化，30 mL/L h3O2阻断内源性过氧化酶，滴加复合消化液室温10 min，滴加兔抗大鼠Sk αactin mAb，37℃孵育120 min；生物素标记羊抗兔IgG， 37℃ 20 min，DAB显色2 min，蒸馏水冲洗终止显色；苏木素复染核1 min，酸乙醇浸泡2 s，常规脱水、透明、封片. 图像用Image Pro Plus 4.0软件分析.

　　统计学处理：实验数据均以x±s表示，应用SPSS10.0 软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用q检验，以P&<0.05为有统计学意义.
　　2　结果
　　实验完毕，获得大鼠38只，剔除MI面积&<30 %或&>55 %大鼠5只，获完整资料大鼠33只：Sham组，MI组，40 mg Sim组各8只，20 mg Sim组9只. 3个心肌梗死组间梗死面积无统计学差异（P&>0.05），平均梗死面积为45.3 %（表1）.
　　2.1　辛伐他汀对MI后心脏形态学和血流动力学的影响
　　MI 组LVWI， RVWI高于Sham组（P&<0.01）. Sim组LVWI， RVWI均低于MI组（P&<0.01），两个Sim组间无统计学差异（P&>0.05，表1）. MI组BPs， BPd， LVSP和±dp/dtmax低于Sham组（P&<0.01），LVEDP高于Sham组（P&<0.01）. Sim组BPs和BPd高于MI组（P&<0.01），LVSP和±dp/dtmax高于MI组（P&<0.05），LVEDP低于MI组（P&<0.05），两个Sim组间无统计学差异（P&>0.05，表1）.表1心脏形态学和血流动力学指标(略)

　　2.2　辛伐他汀对αMHC和βMHC mRNA表达的影响MI组βMHC mRNA表达高于Sham组，αMHC mRNA表达低于Sham组（均P&<0.01）；两个剂量组的Sim干预8 wk均能上调αMHC mRNA表达和下调βMHC mRNA表达. Sim组 αMHC mRNA表达高于MI组（P&<0.01），βMHC mRNA低于MI组（P&<0.01），两个Sim组间无统计学差异（P&>0.05，表2）.表2各组非梗死区 αMHC， βMHC mRNA及Sk αactin蛋白表达(略)
　　2.3　辛伐他汀对Sk αactin表达的影响Sham组胞质内Sk αactin表达呈阳性的心肌细胞少见；MI组梗死区周边区和非梗死区胞质内Sk αactin表达呈阳性的心肌细胞多于Sham组（P&<0.01）；Sim 20 mg组和Sim 40 mg组上述区域的阳性细胞少于MI组（P&<0.05，图1，表2）.
　　2.4　相关性分析Sim组βMHC mRNA的表达与LVWI， RVWI均呈正相关，r分别为0.68， 0.74（均P﹤0.01）；与血流动力学指标LVSP呈负相关（r＝-0.65， P&<0.05），与LVEDP呈正相关（r＝0.61， P&<0.05）. 3讨论
近来发现他汀类药物对心肌细胞肥大存在有益影响，故利用心肌梗死模型进行观察. 因4S试验中采用Sim 20 mg和40 mg两个剂量观察，并发现他汀降脂作用随剂量增加而加强，为了解其非降脂作用是否与剂量有关，我们也采用20 mg/kg·d和40 mg/kg·d两个剂量观察. 前期研究证实：四组间血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇水平无统计学差异［3］. 本实验发现20 mg和40 mg Sim两组非降脂作用无显著性差异，他汀的非降脂作用是否与更小剂量范围内的给药相关，尚有待于进一步研究.
　　MI后8 wk，MI组αMHC mRNA表达低于Sham组，βMHC mRNA表达上调，Sk αactin表达明显增加，表明MI后心肌细胞发生分子重塑. 肌球蛋白重链与肌动蛋白是心肌细胞内的主要收缩蛋白. βMHC与Sk αactin是“胚胎型”收缩蛋白，在胎心中高度表达，出生后逐渐被αMHC与α心肌肌动蛋白取代. MI后神经体液因素及压力负荷变化，均能启动心肌细胞核内即早基因（cfos， cmyc， cjun及Egr1）的转录和翻译，促使αMHC表达下调，βMHC， Sk αactin等表达上调，导致心肌细胞内收缩蛋白含量发生变化，αMHC/βMHC比例也发生改变［7］. 由于MHCs同功型成分与心肌收缩力大小存在因果关系，MHCs成分和比例改变，最终会导致心肌收缩能力减弱，心脏功能受损. “胚胎型”收缩蛋白表达是心肌细胞蛋白质表型发生重塑的主要原因.
　　Sim干预8 wk，能上调MI后受抑制的 αMHC mRNA表达，并抑制 βMHC mRNA在心肌中的过度表达. 提示Sim能在转录水平抑制MI后病理刺激因素引起的“胚胎基因”βMHC在成体心脏的再度表达，减少心肌中“胚胎型”蛋白 βMHC的合成. 这与Bauersachs等［8］发现Sim能改变MI后 αMHC/βMHC比例相一致. 实验结果同时显示，Sim能减少Sk αactin表达. 提示Sim能抑制MI后心肌细胞Sk αactin的合成，逆转心肌蛋白质表型变化，改善心脏收缩功能. Sim的作用可能与阻断甲羟戊酸（MVA）通路，减少胆固醇合成通路的中间产物MVA、双香叶酯基焦磷酸盐（GGPP）、法尼酯焦磷酸（FPP）产生有关［9］， 中间产物减少，可抑制GTPase蛋白（Rac1， Ras， Rho等）的异戊二烯化修饰，影响小GTP蛋白的成熟、定位与激活，导致以细胞外调节激酶（ERK）通路为代表的各种肥大刺激因素诱导的信号转导通路受阻，从而抑制与肥大相关基因的转录和翻译，减少“胚胎型”蛋白合成，减轻细胞分化和增殖，改善心肌肥厚.
　　实验相关性分析显示，Sim组βMHC mRNA表达与LVWI， RVWI呈明显正相关，与反映左室收缩功能的LVSP呈负相关，与反映左室舒张功能的LVEDP呈正相关. 两种MHC的ATPase活性不同，水解ATP速度不同，αMHC水解ATP能力是βMHC的3~4倍以上［10］，MI后αMHC减少，βMHC增多，使肌小节ATPase活性降低，收缩速率减慢，心功能下降，与本实验相关性分析结果一致. 提示心肌细胞的收缩蛋白表型变化是MI后心脏功能减损的基础，而Sim抑制MI后编码“胚胎型”蛋白基因的表达可能是Sim改善心脏功能的原因之一.

参考文献

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