作者：梁宏亮 郑奇军 易定华
【摘要】 目的： 探讨大鼠腹部异位心脏移植模型的外科技巧并改良此模型的制作方法，使其更加简便且成功率高. 方法： 对传统Ono术式的受体准备、供心切取和吻合方法等环节进行改进，采用此改良方法建立SD大鼠的腹部异位心脏移植模型. 结果： 共实施100例大鼠腹部异位心脏移植术，89例成功. 供心缺血时间(32±5)min，整个手术耗时(60±10)min. 结论： 经典的Ono术式经改进后，术中缩短了供心缺血时间，降低了吻合难度，手术成功率高. 整个过程均可单人操作，无需显微镜，使其易于掌握与开展.
【关键词】 心脏移植；大鼠；疾病模型，动物
【Abstract】 AIM: To explore the surgical skills and modify the procedure in making animal models of heterotopic heart transplantation in rats， in order to make it more convenient and improve the success rate. METHODS: Heterotopic heart transplantations of male SD rats were performed by using Onos method with modifications of preparation of recipient， donor cardiectomy and vascular anastomosis. RESULTS: Of the 100 cases receiving heterotopic abdominal heart transplantation， complete success was achieved in 89 cases. Total ischemia time was (32±5)min， and full time of operation was (60±10)min. CONCLUSION: This improved Onos method can shorten the ischemia time， make the anastomosis easier and increase the success rate of heterotopic heart transplantation. The whole process can be completed by a single man without microscope assistance， so this method is easy to learn and perform.
【Keywords】 heart transplantation; rats; disease models， animal
0 引言
大鼠异位心脏移植模型是免疫学诸多研究领域尤其是器官移植中最重要的动物模型之一. 此模型的建立最早于1964年由Abbott等［1］人报道，在1969年经Ono等［2］的改进后，使其成为基本的、经典的术式. 我们在建立此模型的过程中对受体准备、供心切取、吻合方法等环节进一步改良，并通过100例手术实践，不需要手术显微镜即获得了较高的成功率，使此模型的制作更加简便、快捷，易于掌握，易于开展.
1 材料和方法
1.1 材料动物：
供体与受体均为SD大鼠（购于第四军医大学试验动物中心），雄性，体质量200~250 g，常规饲养. 药品与器械：戊巴比妥钠、肝素钠注射液、硫酸庆大霉素注射液、 9 g/L生理盐水、医用乙醇、显微外科手术器械（上海医疗器械厂）、9/0及4/0无损伤缝合线、自制S形拉钩（棉线一端带S形大头针）、眼科剪、眼科镊.
1.2 方法
整个手术单人完成，为清洁级手术.
麻醉使用10 g/L戊巴比妥钠腹腔注射，40 mg/kg. ① 受体手术：受体鼠仰卧位固定于手术板上，乙醇消毒腹部，从正中线开腹，自制S形拉钩将腹壁牵向两侧. 用温生理盐水纱布包裹肠管后将肠袢推向术者右侧，充分暴露手术视野. 在肾静脉和髂腰静脉之间，用9/0缝合线结扎下腔静脉两侧及背部的细小分支血管. 腹腔内注入硫酸庆大霉素4万U以及生理盐水1 mL，进行补液及预防感染. 最后温生理盐水纱布覆盖手术切口. ② 供心切取：乙醇消毒供体腹部及胸部皮肤，正中线开腹暴露下腔静脉. 从下腔静脉缓慢注入肝素生理盐水3～5 mL（浓度5万U/L），供体肝素化后剪开下腔静脉放血. 随即做前胸壁“U”形切口并将其翻向头侧固定. 把准备好的生理盐水冰泥迅速置入胸腔内降温. 心脏停跳后打开心包，剪除胸腺. 在升主动脉与肺动脉下沿心包横窦穿过4/0缝合线，集束结扎除主动脉、肺动脉以外的全部血管以及左心耳. 用眼科镊钝性游离升主动脉，在其与无名动脉分叉下方剪断. 同法游离肺动脉干，并于距心脏约5 mm处剪断. 接着在集束结扎线下剪取供心，放入0～4℃肝素生理盐水中. 用去除头皮针的软管插入升主动脉中缓慢地灌注冷肝素盐水，直至肺动脉流出液变清澈，心肌发白、松软. 使用9/0带针缝线分别在肺动脉上、下两角缝合一针，均为从外壁进针，内壁出针，留线备用. ③ 心脏移植：肉眼下进行供心移植，使用端侧吻合法. 分别在受体肾静脉与髂腰静脉水平处用4/0缝合线临时阻断腹主动脉和下腔静脉. 接着用5 mL注射器针头在下腔静脉前壁刺破一孔，经此孔用显微剪向上纵行剪开前壁. 用冰棉片包裹供心及升主动脉，只露出肺动脉，并置于下腔静脉左侧. 首先用肺动脉上角留好的缝线在下腔静脉切口上角由内壁进针，外壁出针缝合一针后打结，留线尾. 接着按下腔静脉外壁进针，肺动脉内壁出针的顺序，从上到下连续缝合下腔静脉切口右侧壁，针距和边距相等且均匀，单侧吻合8针左右，打结后完成一侧的吻合. 之后将心脏翻转到下腔静脉右侧，由下向上连续缝合对侧下腔静脉壁，打结前注意用生理盐水冲洗排出腔内空气，至此静脉吻合完毕. 将供心再次翻转于下腔静脉左侧. 使用上述方法在腹主动脉前壁做纵行切口，注意此切口要高于下腔静脉吻合口约2/3. 动脉的吻合始于升主动脉和腹主动脉的上角，缝合一针后打结留线尾，然后按腹主动脉外壁进针，升主动脉内壁出针的顺序，从上到下连续缝合腹主动脉切口左侧壁，其余吻合同静脉，吻合完毕注意排气后打结. 血管吻合完成后，先用眼科镊松开远心端的阻断线，再缓慢松开近心端阻断线. 循环开放后供心颜色迅速变为鲜红，心肌由纤颤变为节律性收缩. 确保吻合口无出血、狭窄、扭曲后，将供心置于受体鼠的右下腹，使肠管复位，温盐水冲洗腹腔后注入硫酸庆大霉素2万U，并视失血情况腹腔内注入生理盐水1～3 mL. 4/0缝线分两层关腹. ④ 术后处理：将受体鼠放入自制保温盒内，注意保温. 麻醉清醒后分笼饲养，自由饮食. 术后可给予糖盐水，每250 mL饮水内加入8万U硫酸庆大霉素. 每天对腹部供心进行触诊，以供心搏动72 h为手术成功标准.
统计学处理： 用SPSS14.0统计软件进行处理，计量资料用x±s描述，计数资料用率表示.
2 结果
共实施大鼠腹腔内异位心脏移植100例，成功89例，成功率为89%. 其中吻合口漏血造成的失血过多死亡4例，术中误伤供心造成失血过多死亡2例，麻醉意外引起死亡3例，术后肠梗阻造成的肠管坏死引起死亡1例，由于供心缺血时间太长造成供心不复跳1例. 受体血管准备时间（6±2）min，供心摘取时间（10±2）min，肺动脉吻合时间（12±3）min，主动脉吻合时间（8±2）min，供心缺血时间（32±5）min，供心恢复血液循环至供心恢复节律收缩时间（供心纤颤时间）（38±23）s，整个手术耗时（60±10）min.
3 讨论
目前，大鼠腹部异位心脏移植模型已成为器官移植基础研究领域中应用最广泛的动物模型［3］. 其移植心脏的循环途径为：受体腹主动脉供心升主动脉冠状动脉心肌冠状静脉右心房右心室供心肺动脉受体下腔静脉，供心没有射血功能. Abbott等［1］报道此模型有五大优点： ① 在整个心脏移植过程中只需要吻合两根血管；② 移植术是否成功易于观察、判断；③ 易于监测移植物的生命力；④ 有明确的移植排斥反应终点；⑤ 心电图（ECG）可用于反映微小的免疫病理学变化. 正是因为这些优点，其被全世界的研究人员广泛使用，并相继出现许多改良技术［3-9］. 但由于此模型的建立要求术者有较高的显微外科手术技能，因此限制了其应用. 我们吸取了多种改良技术的优点，并通过实践做出进一步改进，使此模型的制作不需要特殊的手术显微镜即可完成，使其更加简便、易学、易于开展而且成功率高. 我们对此模型制作的改进包括① 受体准备：先准备好受体血管可明显减少供心冷缺血时间，有利于供心保护；大鼠下腔静脉壁很薄，术中不必分离下腔静脉和腹主动脉，即可节约手术时间又可防止剥离过程中造成下腔静脉破裂.
术中出血、麻醉不当、供心缺血时间长以及受体鼠内环境紊乱是建立此模型过程中最主要的失败原因，因此在手术中还需要注意① 麻醉：麻醉前对受体鼠禁食8~12 h，可避免因肠内容物过多而引起的肠功能恢复障碍. 戊巴比妥钠使用超量易造成试验动物的呼吸抑制或骤停. 我们使用10 g/L戊巴比妥钠40 mg/kg可取得较为满意的效果. 麻醉效果良好的判断标准为：动物呼吸均匀，术后3 h内动物即可苏醒. ② 受体准备：将肠管放置于术者右侧比左侧更有利于手术视野暴露和接下来吻合血管时供心的摆放. 在将肠管移出腹腔时要注意避免肠袢的扭转，防止肠管缺血坏死. 结扎下腔静脉背侧分支血管时，易误伤引起出血，且止血较为困难. 我们的经验是游离下腔静脉与腹主动脉时先钝性剥离其两侧的结缔组织，暂时保留血管壁上的. 这些结缔组织可用来轻提腹主动脉，在直视下从无血管区引线，结扎血管后再予以剥离. ③ 供心切取：开胸后要迅速使供心降温并停搏，以减少供心在无氧代谢下的能量消耗. 供心行主动脉灌注时速度要缓慢，避免损伤主动脉瓣. ④ 心脏移植：受体血管切口应稍小于供心的相应血管口径，可避免打结时张力过大而撕扯血管壁. 静脉切口还应略大于动脉切口，防止出现相对性狭窄，造成恢复循环后供心血液回流不畅. 受体、供体血管两角固定后连续缝合的第一针的针距要小，以后的针距要保持均匀，这样可有效减少吻合口漏血. 吻合完最后一针打结前，注意排出血管腔内的残留空气，以防气栓形成. 血管吻合完毕后有少量出血，可压迫止血，如果难以止住，可以多次松放阻断线，动脉压可使吻合口缝线排列更加均匀，并使针眼处有凝血机会. 但如果有向外射血，需要及时阻断血管，在出血部位加缝1~2针. 心脏表面和集束结扎血管处的出血可行“8”字缝合止血. 静脉吻合口的下角和动脉吻合口的上角是相对易于漏血的部位，需要特别关注. ⑤ 术后处理： 大鼠在麻醉下体温下降，对其代谢和生理功能都有影响，所以保温十分重要. 给动物覆盖棉布或灯照等方法简便、易行，效果可靠；受体鼠在术后麻醉复苏的过程中应使用俯卧位，将头侧向一边. 这样可以防止舌后坠，并利于口腔内分泌物流出，以保证其呼吸道通畅.
总之，大鼠异位心脏移植模型经过多年的实践运用，已成为研究移植排斥反应、器官保存和药物评价等诸多领域最重要的动物模型之一. 我们对此模型的制作进行了改良，使其不需要特殊的手术显微镜即可完成，而且有较高的重复率和成功率，更加简便、快捷、易于开展.
【参考文献】
［1］Abbott CP， Lindsey ES， Creech O Jr， et al. A technique for heart transplantation in the rat［J］. Arch Surg， 1964， 89(10): 645-652.
［2］Ono K， Lindsey ES. Improved technique of heart transplantation in rats［J］. J Thorac Cardiovasc Surg， 1969， 57(2): 225-229.
［3］Wang D， Opelz G， Terness P. A simplified technique for heart transplantation in rats: Abdominal vessel branchsparing and modified venotomy［J］. Microsurgery， 2006，26(6):470-472.
［4］Wang K， Zhang N， Li H. Improved technique of mouse heterotopic heart graft retransplantation［J］. Microsurgery， 2006， 26(3): 200-202.
［5］Akpinar E， BilginA N. A simple technical modification for abdominal cardiac transplantation in rats［J］. Transplant Proc， 1998， 30(3): 807-808.
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［8］Dedja A， DallOlmo L， Cadrobbi R， et al. Heterotopic cardiac xenotransplantation in rodents: Report of a refined technique in a hamstertorat model［J］. Microsurgery， 2005， 25 (3): 227-234.
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