关于chk1反义寡核苷酸增加HeLa细胞顺铂作用下凋亡敏感性

　　　　　　　　 作者：朱克修，王佳，李玢，曹亚莉，韩晓兵

【摘要】 　　目的：通过反义封闭chk1基因，阻断细胞周期检测点信号传导通路，从而增加宫颈癌HeLa细胞对顺铂(DDP)的敏感性. 方法：采用MTT法检测梯度浓度DDP作用人宫颈癌细胞株HeLa 24，48和72 h后对细胞的生长抑制率. 以脂质体为载体将chk1正义链和反义链转染HeLa细胞，用Western Blot测量Chk1蛋白的表达，用流式细胞仪和TUNEL法检测DDP作用后细胞凋亡率. 结果：DDP对HeLa细胞有生长抑制作用，并有时间和浓度依赖性. 反义封闭chk1基因可抑制Chk1蛋白表达（P&<0.01）， DDP作用下细胞凋亡率为54.1%，高于转染正义链的34.2%（P&<0.01）. 结论：反义封闭chk1基因可增加HeLa细胞对DDP的凋亡敏感性.
【关键词】 Chk1基因；反义核酸技术；宫颈肿瘤；顺铂
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of chk1 gene in cisplatinresistance of cervical cancer to block the signal transduction pathways of cell cycle checkpoint， by targeting chk1 gene using antisense oligonucleotide， so as to enhance the drug sensitivity of cervical cancer HeLa cells to DDP. METHODS: The proliferation inhibition rates of HeLa cells by DDP in different concentrations were measured by MTT assay. Oligonucleotide was transfected into HeLa cells.The expression of Chk1 was observed by Western Blot. The apoptosis rate of HeLa cells induced by DDP was investigated by flow cytometry and TUNEL. RESULTS: The growth inhibition rate of HeLa cells increased gradually in a time and concentration dependent manner. Transfection with antisense oligonuleotide targeting chk1 inhibited the expression of Chk1 protein (P&<0.01)， and the apoptosis rate (54.13%) was significantly higher than that of the sense blocking (34.20%， P&<0.01). CONCLUSION: Antisense blocking of chk1 increases the apoptosis sensitivity of HeLa cells to DDP.
　　【Keywords】 chk1 gene；antisense nucleic acid technology; cervix neoplasms; DDP
　　0 引言
　　宫颈癌是世界范围内女性第二大恶性肿瘤. 近年来以顺铂（cisplatin，DDP）为核心的联合化疗在宫颈癌治疗中取得了一定进展. 有研究认为，细胞周期检测点途径主要由ATM，ATRChk1/2Cdc25A，Cdc25B，Cdc25C轴组成［1］，细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase1，Chk1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞周期检测中最关键的效应蛋白激酶［2］. 以chk1为作用靶点，干扰细胞损伤修复机制，提高肿瘤治疗的敏感性可能成为一种有效的治疗选择. 我们以chk1反义寡核苷酸链转染HeLa细胞，观察其化疗后的凋亡敏感性.
　　1 材料和方法
　　1．1 材料
　　人宫颈癌HeLa细胞株由西安交通大学医学院第一附属医院临床研究医学分子中心提供. 在37℃， 50 mL/L的CO2条件下用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基培养. RPMI 1640购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT购自Amressco公司；转染试剂LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司；鼠抗人Chk1 mAb购自Neomarkers公司；辣根酶标记的羊抗鼠抗体购自博士德公司；ECL购自Amersham Bioscience公司；Annexin VFITC试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自华美生物公司.
　　1．2 方法
　　实验分4组：正常对照组(A组)，细胞未经任何处理；空脂质体组(B组)；转染chk1正义寡核苷酸链组(C组)；转染chk1反义寡核苷酸链组(D组). B~D组转染后用20 μmol/L DDP处理24 h.
　　1．2．1　MTT法检测
　　DDP对细胞的生长抑制率取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞密度5×107/L，接种于96孔板， 200 μL/孔，培养24 h后DDP终浓度为10，20，40，80和160 μmol/L，每个浓度设4个平行孔，并同时设阴性对照(不加药物)和空白对照（无细胞），分别于作用24，48和72 h后加入5 g/L的MTT溶液，20 μL/孔，继续培养4 h后，吸去上清，加入二甲基亚砜，150 μL/孔，振荡器震荡10 min，使结晶溶解完全，用酶标仪在490 nm波长处测量A值，计算细胞增殖抑制率（%）. 绘制DDP对HeLa细胞的生长抑制曲线.
　　1．2．2　转染效率的检测
　　chk1反义寡核苷酸序列根据参考文献［3-4］的方法，由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列为：chk1反义链：5′GGCACTGCCATGACTCCA 3′;正义链：5′TGGAGTCATGGCAGTGCC3′，采用全硫代修饰，部分寡核苷酸链的5′端以FITC标记. 严格按照LipofectamineTM 2000试剂说明书进行转染，于转染前1 d用无抗生素的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640调整细胞密度为2.5×108/L，接种于24孔板，500 μL/孔. 转染当天换为500 μL无抗生素无血清RPMI 1640. 分别取不同量的荧光标记的寡核苷酸链(0.6，0.8和1.0 μg)加到50 μL的RPMI 1640中，混匀. 再取LipofectamineTM 2000 2 μL，加到50 μL的RPMI 1640中混匀. 室温放置5 min后，将分别混有寡核苷酸链和LipofectamineTM 2000的RPMI 1640混合，室温放置20 min（寡核苷酸链与脂质体比值分别为0.6 μg∶2 μL；0.8 μg∶2 μL和1.0 μg∶2 μL）. 将上述混合物加入24孔板中，轻轻混匀，培养6 h后，将培养基换为500 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640，继续培养至24 h，荧光倒置显微镜下观察转染效率.
　　1．2．3　Western Blot法检测
　　Chk1蛋白表达裂解提取HeLa细胞总蛋白，按Bradford法进行蛋白定量，煮沸5 min使蛋白变性，120 g/L的SDSPAGE电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于50 g/L脱脂奶粉中室温封闭1 h，以鼠抗人的Chk1 mAb按1∶400室温孵育1.5 h，用TBST洗膜6次，每次3 min，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗1∶500室温孵育1 h，TBST洗膜6次，每次3 min，以ECL显色，X光胶片暴光，洗片. 用凝胶成像系统检测蛋白表达灰度值.
　　1．2．4　细胞凋亡的检测
　　收集细胞，调整细胞浓度为1×108/L，取细胞1 mL，PBS洗涤后将细胞悬于Binding Buffer 200 μL，加Annexin VFITC 10 μL，混匀，室温避光孵育15 min，再加入Binding Buffer 300μL和PI(碘化丙啶) 5 μL，流式细胞仪检测细胞凋亡. 另将HeLa单细胞悬液接种于24孔培养板培养，使细胞爬于盖玻片，按上述各组方法处理细胞后捞出盖玻片，40 g/L多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒说明进行操作.
　　统计学处理：重复3次实验，实验结果采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析及两两比较，P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2　结果
　　2．1　DDP对HeLa细胞的生长抑制作用结果显示，A组HeLa细胞体外生长良好，10 μmol/L DDP作用HeLa细胞24 h后抑制效应不明显，20，40，80和160 μmol/L DDP对HeLa细胞有抑制效应，且随着时间的延长和浓度的增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点（图1）. 由于20 μmol/L DDP作用24 h后对细胞已有明显的抑制作用，因此后面的实验中选用20 μmol/L为药物处理浓度.
　　2．2　寡核苷酸转染效率用FITC标记的寡核苷酸转染HeLa细胞，24 h后用荧光倒置显微镜观察转染效率，发现DNA/LipofectamineTM 2000脂质体比率为0.6 μg∶2 μL；0.8 μg∶2 μL和1.0 μg∶2 μL时的转染效率分别为98.9%，99.8%，99.0%，其中DNA/LipofectamineTM 2000脂质体比率为0.8 μg∶2 μL时转染效率最高.
　　2．3　HeLa细胞Chk1蛋白的表达转染chk1反义寡核苷酸可明显抑制Chk1蛋白的表达（图2）， 与A组， B组和C组比较差异具有统计学意义（P&<0.01）.
　　2．4　chk1反义寡核苷酸对顺铂作用下HeLa细胞凋亡的影响转染chk1反义寡核苷酸后DDP诱导的细胞早期凋亡和晚期凋亡总共有［(54.1±1.0)%， P&<0.01］，高于C组［(34.2±1.0)%， P&<0.01］，说明转染chk1反义寡核苷酸可增加DDP诱导的HeLa细胞凋亡. TUNEL染色显示，转染chk1反义寡核苷酸链后HeLa细胞在DDP作用下凋亡率为57.2%，是C组凋亡率（24.9%）的2.3倍，检测结果与Annexin V/PI流式细胞仪检测法获得结果一致（图3）.

　3　讨论
　　DDP是目前发现的抗癌活性最强的药物之一，以DDP为主或有DDP参加配伍的化疗方案占所有方案的78%~80%. 但肿瘤对DDP的耐药性影响了DDP的治疗效果. chk1是近年来发现的细胞周期调控基因. 细胞在DNA损伤发生后，chk1激活导致细胞周期阻滞并激活DNA损伤修复系统，以维持细胞基因组的稳定性［5］，使细胞能正常增殖分化，避免凋亡. 有研究报道蛋白酶抑制剂UCN01可抑制Chk1表达，消除药物和放射线作用后细胞周期阻滞，增加细胞毒作用［6-8］. 因此，我们推测抑制chk1的表达可能会增加宫颈癌对DDP的凋亡敏感性.
　　我们首先分析了DDP对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制作用，结果显示DDP对HeLa细胞生长有明显的抑制作用，且随着时间的延长和浓度的增加，其抑制作用越来越明显，呈时间浓度依赖性特点. 然后我们以chk1为研究对象，合成chk1反义寡核苷酸，以脂质体介导转染HeLa细胞，封闭Chk1蛋白表达，检测DDP作用下细胞凋亡情况. 由于脂质体和寡核苷酸的毒性可诱导细胞的非特异性凋亡，我们同时合成chk1正义寡核苷酸，以转染chk1正义寡核苷酸组和空脂质体组作为对照，并通过转染效率的检测确定了最佳转染条件，以准确反映chk1反义寡核苷酸对细胞的特异性促凋亡作用. 我们的研究结果显示：Chk1在转染反义寡核苷酸的细胞中的表达明显降低，说明Chk1蛋白的表达可受chk1反义寡核苷酸有效抑制，而不受其正义链的影响. 转染chk1反义寡核苷酸可特异性促进DDP诱导的细胞凋亡. Bull等［9］报道的分子伴侣Hsp90抑制剂17DMAG通过抑制Chk1表达，使3株人肿瘤细胞的放射敏感性增加，在体内可以抑制照射后肿瘤的生长. 国内有研究报道chk1反义寡核苷酸可明显提高白血病细胞对药物治疗的敏感性［10］，与本实验结果一致.
【

参考文献

】
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