关于吡格列酮预处理对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体ATP敏感性钾通道的影响

　　　　　　　　 作者：李健，冯义柏，田莉，郎明健，杨汉东

【摘要】 　　目的: 观察吡格列酮(Pio)对在体大鼠心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体ATP敏感性钾通道影响，探讨Pio对心肌缺血损伤保护作用及其机制. 方法: 24只SD大鼠随机分为假手术组（SO组），缺血/再灌注组（I/R组），Pio预处理组（Pio组）和线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂5羟基葵酸（5HD）+Pio组（5HD+Pio组）4组. 各组于缺血/再灌注前24 h尾静脉注射相应溶媒及药物，5HD+Pio组注入5HD 10 mg/kg 30 min后再给予Pio 3 mg/kg；Pio组只注入Pio 3 mg/kg；SO组不结扎前降支，4 h后取出心脏；余三组结扎前降支30 min，再灌注4 h后取出心脏. 用透射电镜观察心肌线粒体超微结构的改变；采用TUNEL法和免疫组化法检测缺血心肌细胞凋亡和Bcl2，Bax，Caspase3蛋白的表达以及RTPCR法测Fas mRNA的表达. 又另取18只SD大鼠随机分成SO，I/R和Pio组，行心肌梗死范围的测定. 结果：①与I/R组相比，Pio组线粒体损伤程度明显减轻；②与I/R组（34.93±5.55）%相比，Pio组（20.24±3.93）%心肌梗死范围明显减少（P&<0.05）；③与I/R组相比，Pio组能明显增加Bcl2蛋白的阳性细胞指数（P&<0.05），降低心肌细胞凋亡率（P&<0.05）及Bax， Caspase3蛋白的阳性细胞指数（P&<0.05），下调Fas mRNA的表达水平. I/R组与5HD+Pio组相比，差异无统计学意义(P&>0.05). 结论：Pio预处理可通过保护心肌线粒体结构，减少心肌细胞凋亡及梗死范围，保护缺血心肌损伤作用可被线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂所对抗.
【关键词】 吡格列酮；缺血再灌注；凋亡；线粒体；钾通道
　　【Abstract】 AIM: To observe the effects of pioglitazone on myocardial apoptosis induced by myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury and mitochondria ATPsensitive potassium channel in rats in vivo and to explore the mechanism of pioglitazone protection from myocardial I/R injury. METHODS: Twentyfour healthy SpragueDawley rats were randomly pided into 4 groups: shamoperated group， I/R group， pioglitazone treatment group and 5hydroxydecanoic acid (5HD)+pioglitazone group. Apart from the shamoperated group， I/R， pioglitazone and 5HD+pioglitazone groups were administered solvent or drugs intravenously 24 h before occlusion， which were respectively 0.9% saline， pioglitazone (3 mg/kg) and 5HD (10 mg/kg) plus pioglitazone (3 mg/kg). In 5HDpioglitazone group， 5HD was given 30 min before pioglitazone injection. The shamoperated group was not ligated， while the left anterior descending branch was ligated for 30 min in I/R， pioglitazone and 5HD+pioglitazone groups. Then the left anterior descending branch was reperfused. Four hours later， the hearts were quickly removed to be used for observing the ultrastructure of mitochondria and measuring the apoptosis rate by TUNEL and detecting the expressions of Bcl2， Bax， Caspase3 proteins with immunohistochemistry and Fas mRNA with RTPCR. Eighteen healthy SpragueDawley rats were randomly pided into 3 groups: shamoperated group， I/R group， pioglitazone treatment group and the size of myocardial infarction was detected. RESULTS: ①Compared with I/R group， the damage of mitochondrial ultrastructure in pioglitazone group was depressed. ②The infarct size was （34.93±5.55）% in I/R group while pioglitazone reduced the infarct size to （20.24±3.93）% (P&<0.05). ③Compared with shamoperated group， the apoptosis and positive cell index (PCI) of Bcl2， Bax， Caspase3 proteins and the level of Fas mRNA in I/R， pioglitazone and 5HD+ pioglitazone groups were increased (P&<0.05). Compared with I/R group， the apoptosis rate and PCI of Bax， Caspase3 proteins and Fas mRNA in pioglitazone group were greatly decreased (P&<0.05)， while the PCI of Bcl2 protein was increased (P&<0.05). However， the differences between I/R group and 5HD+pioglitazone group were not significant (P&>0.05). CONCLUSION: Pioglitazone can protect the heart from I/R injury by improving mitochondrial ultrastructure and reducing infarct size， and by decreasing apoptosis. The cardioprotective effects can be inhibited by blocker of mitochondrial ATPsensitive potassium channel.
　　【Keywords】 pioglitazone; ischemia reperfusion; apoptosis; mitochondrial; potassium channel
　　0　引言
　　心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion injury， I/R）损伤是冠脉再通后重要并发症［1］，目前尚没有一种药物被批准用于临床. 因此，寻求一种具有临床应用前景的预处理药物，尤其寻找可以同时治疗糖尿病并保护心肌I/R损伤的药物，具有重要的临床意义. 本实验以在体大鼠为模型，通过观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activated receptorγ， PPARγ)激动剂吡格列酮(pioglitazone)对大鼠心肌I/R损伤的延迟保护，以及对心肌梗死面积、心肌形态及线粒体超微结构改变、心肌细胞凋亡的作用，探讨Pio对线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATPsensitive K+， mitoKATP）的影响，为临床寻找可以同时治疗糖尿病并保护心肌I/R损伤的药物提供依据.
　　1　材料和方法
　　1.1　材料
　　健康雄性SD大鼠24只，体质量250～300 g，同济医学院动物中心提供. 盐酸吡格列酮（批号M050601，北京太平洋药业）；5羟基葵酸(5HD)，伊文思（Evans） 蓝（美国Sigma公司）；红四氮唑（TTC）（美国Amresco公司）；TUNEL试剂盒（上海罗氏公司）；Bax，Bcl2，Caspase3免疫组化ABC抗体试剂盒（美国Santa Cruz公司）；Trizol（美国Gibco公司），其他试剂为国产试剂.
　　1.2　方法
　　1.2.1　实验分组将大鼠随机分4组，每组6只. 假手术组（SO组）：行冠脉穿线但不结扎；心肌缺血/再灌注组（I/R组）：于缺血/再灌注前24 h由尾静脉注入9 mL/L生理盐水，开胸结扎冠脉前降支30 min，松解后再灌注4 h；线粒体ATP敏感性钾通道阻滞剂5HD+Pio组（5HD+Pio组）：于缺血/再灌注前24 h由尾静脉缓慢注入5HD 10 mg/kg，30 min后再缓慢注入Pio 3 mg/kg，持续5 min，24 h后处理同I/R组；Pio预处理组(Pio组)：于缺血/再灌注前24 h只注入Pio 3 mg/kg，持续5 min，余处理同5HD+Pio组. 然后，于再灌注4 h后迅速取心脏标本，石蜡包埋后切片，免疫组化检测凋亡蛋白Bcl2，Bax，Caspase3蛋白表达. TUNEL法观察心肌细胞凋亡. 同时取缺血区心肌（SO组穿线下相应部位）各两块，一块迅速液氮保存，行RTPCR检测各组凋亡基因Fas mRNA的表达；另一块放入25 mL/L戊二醛固定后行电镜超微结构观察. 另取SD大鼠18只，分为SO组，I/R组及Pio组，再灌注4 h后，测心肌缺血及梗死范围.
　　1.2.2　模型建立参照文献［2］的方法建立动物模型. 10 mL/L戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧固定，记录II导联心电图，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸（EXP/INSP=1∶2，呼吸60次/min，潮气量14～16 mL），经3～4肋间打开胸腔，用自制简易拉钩将其撑开以暴露心脏，剪开心包膜，找到左心耳和肺动脉圆锥，在左心耳根部下方2 mm处以50线进针，穿过心肌表层在肺动脉圆锥处稍下方穿线，结扎冠脉前降支，将丝线两端穿过自制的一根长2 cm，直径3 mm的聚乙烯小管，轻轻拉紧丝线两端，用小止血钳夹持细管，在II导联心电图见R波明显增大伴ST段即刻抬高，结扎线以下心肌组织颜色变暗，说明心肌已缺血，30 min后松开止血钳，拨去细管，使前降支血流再通行再灌注. 逐层缝合胸腔，待大鼠麻醉复苏后，拔掉气管，再灌注4 h后，采用颈椎脱臼法迅速处死动物，打开胸腔取出心脏，PBS液冲洗残留血液，待检.
　　1.2.3　心肌梗死面积的测定模型建立成功后，缺血/再灌注4 h，重新麻醉，打开胸腔，重新结扎冠状动脉， 迅速从一侧颈动脉套管注射0.01 mol/L伊文思蓝溶液（溶于PBS液）1 mL， 待心脏充分染成蓝色后迅速取出心脏， 放入PBS 溶液(0.02 mmol/L， pH=7.4)中漂洗数次， 将心肌标本置于-20℃冰箱1 h， 取出待其稍解冻后， 沿垂直心脏纵轴方向从心尖到结扎线下方将其切成2～3 mm厚的薄片， 共约7或8片; 在解剖显微镜下小心分离蓝色未缺血区域和红色缺血区域; 将红色的缺血心肌片置于10 mol/L TTC磷酸缓冲液(pH=7.4)中， 在37℃下染色20 min; 缺血但未梗死心肌染成砖红色， 梗死心肌则为土黄色， 呈不规则或岛屿状分布; 再次在解剖显微镜下分离缺血未梗死心肌和梗死心肌；最后用电子天平精确称取缺血未梗死心肌和梗死心肌的湿质量. 测量和计算心肌缺血范围用缺血心肌质量/左室总质量×100％来计算；心肌梗死范围用梗死心肌质量/缺血心肌质量×100％来表示.
　　1.2.4　心肌透射电镜检查将各组切取小块心肌在25 mL/L戊二醛固定2 h后， 送同济医学院超微病理室， 经清洗、 固定、 梯度脱水、 包埋后， 在80℃恒温箱内放置10 h聚合， 修组织块， 做超薄切片， 用醋酸双氧铀、 拘缘酸铅双重染色各10 min， 用荷兰FEI Tecnai G212型透射电镜观察心肌超微结构， 并拍片分析.
　　1.2.5　HE，免疫组化染色及原位心肌细胞凋亡检测TUNEL法取四组组织，经100 g/L甲醛固定后，送同济医学院病理室，常规石蜡包埋，4 μm切片，二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，再行HE染色；按Bax，Bcl2，Caspase3免疫组化ABC抗体试剂盒及TUNEL试剂盒说明书，行免疫组化染色，封片，干燥过夜，在镜下观察并照片. TUNEL标记前用DNA酶处理切片做阳性对照，用标记液代替TUNEL反应液做阴性对照. 判定标准：阳性表达细胞为棕黄色，Bcl2为核膜和胞质表达；Bax蛋白主要存在胞质，部分在胞核；Caspase3则主要在胞核表达，部分在胞质； TUNEL阳性细胞核和细胞碎片呈深浅不一的棕黄色. 每张切片随机选10个视野（×400）. 计算凋亡指数（apoptosis index，AI）％=（视野内凋亡细胞个数/视野内所有心肌细胞个数）×100％. 用HMIAS2000型全自动医学彩色图像分析系统（同济医学院病理室提供），计算阳性细胞指数＝阳性细胞平均光密度值×阳性细胞占整个视野的面积百分比，反映各组Bcl2，Bax和Caspase3蛋白表达情况.
　　1.2.6　Fas基因的mRNA表达水平检测及半定量分析
　　采用RTPCR法检测心肌组织中Fas及βaction（作为内参）的mRNA表达水平. Fas基因引物序列为5′ sense: 5′ATGCTGTGGATCATGGCTGTC3′ (56~76); 3′ antisense: 5′ATCTTGGGGGCTGTTGTGC3′ (811~829)， 774 bp;以βactin为内参照，引物序列为: 5′ sense: 5′ACCTTCAACACCCCAGCCATGTACG3′ (376~400); 3′ antisense: 5′CTGATCCACAT CTGCTGGAAGGTGG3′ (1049~1073)， 698 bp（引物由上海生工合成）.
　　反应条件为：预变性：95℃，5 min；变性：94℃，30 s；退火：61.4℃，30 s；延伸：72℃，30 s， 共9个循环. 退火温度改为55℃，变性，延伸温度不变，27个循环. 最后终末延伸72℃，10 min. RTPCR产物分析：预先做好琼脂糖凝胶，取标本3 μL和Loading Buffer 2 μL混合，在0.5的TBE电泳缓冲液中以电压100 V电泳20 min检测，重复5次. 电泳条带以成像系统进行图像分析并照相.

转贴于 　统计学处理：实验数据以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两组间多重比较用LSDt检验，采用SPSS 11.0统计学软件分析，P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2　结果
　　2.1　Pio预处理对缺血/再灌注心肌梗死范围的影响I/R组与Pio组相比，心肌梗死范围为（34.93±5.55 ）% 和(20.24±3.93)%，两组间差异有统计学意义（P&<0.05）；但两组心肌缺血范围分别为(48.70±3.73)%和(44.88±3.08)%，差异无统计学意义 (P&>0.05).
　　2.2　Pio预处理对心肌线粒体超微结构及形态学的影响心肌透射电镜（图1）可见SO组大鼠心肌线粒体结构正常；I/R组可见线粒体肿胀，嵴明显减少或消失，形成电子透亮区，基质成斑点状，甚至空泡状，灶性空化，肌丝断裂；Pio组线粒体基质颗粒部分消失，嵴排列欠整体，少部分断裂，肌丝结构基本完整，排列欠清晰，与I/R组相比线粒体损伤程度明显减轻；5HD+Pio组与I/R组差异不大. HE染色可见I/R组大鼠心室肌有大小不一出血点和坏死灶，心肌细胞间可见炎性细胞，胞核减少，细胞肿胀，心肌纤维排列不整体，染色增强，嗜碱性变，有肌溶解改变；5HD+Pio组与I/R组相似；Pio组与I/R组相比炎性细胞明显减少，心肌纤维排列较整体，未见坏死灶.
　　2.3　Pio预处理对Bcl2，Bax和Caspase3蛋白表达及凋亡指数的影响I/R组和5HD+Pio组Bax和Caspase3表达明显升高（P&<0.05），而Pio组明显低于I/R组和5HD+Pio组（P&<0.05）；I/R组，5HD+Pio组和Pio组的Bcl2蛋白表达较SO组升高，Pio组明显高于I/R组和5HD+Pio组（P&<0.05）；I/R组和5HD+Pio组间差异无统计学意义(P&>0.05，表1).表1各组缺血心肌Bcl2， Bax和Caspase3蛋白表达阳性细胞指数（略）
　　SO组AI为9.23±6.83；I/R组和Pio组AI为55.44±6.63和28.19±4.93，两组间差异有统计学意义（P&<0.05）；5HD+Pio组AI为52.00±4.11，与I/R组相比差异无统计学意义(P&>0.05).
　　2.4　Pio对Fas mRNA表达的影响I/R组Fas mRNA表达积分A值为0.77±0.05， Pio组为0.44±0.04，较I/R组明显降低(P&<0.05)；5HD+Pio组为0.75±0.05与I/R组相比差异无统计学意义(P&>0.05).
　　3　讨论
　　PPARγ在心血管系统的广泛表达是TZDs发挥作用的基础［2］. Yue等［3］发现罗格列酮能减少I/R糖尿病大鼠的梗死面积并改善心肌的收缩功能. 本实验以在体大鼠I/R为模型，结果显示Pio预处理24 h后能明显减少心肌梗死面积；心肌透射电镜线粒体超微结构观察显示Pio预处理对线粒体有明显保护作用；HE，免疫组化染色以及TUNEL法证实Pio能减少I/R心肌细胞凋亡. 本实验从形态学和生物化学角度说明Pio预处理对大鼠I/R心肌细胞凋亡及心肌线粒体有延迟性保护作用.
　　新近通过线粒体钾通道开放剂和阻止剂的研究发现：增加线粒体钾通道流入促成细胞防御能对抗缺血损伤［4］. 线粒体钙超载在I/R损伤中起主要作用. Liu等［5］ 研究发现激活mitoKATP开放，引起钾离子内流，膜去极化使质子泵建立起来的膜电位降低， 降低钙摄取驱动力，抑制Ca2+内流，能有效防止线粒体钙超载，从而减轻I/R损伤. 实验结果显示Pio预处理能明显减轻I/R损伤，而该保护作用又能被mitoKATP阻滞剂5HD所阻断，推测Pio具有激活线粒体内膜mitoKATP，钾通道开放作用，从而减轻I/R心肌损伤及心肌线粒体有延迟性保护作用.
　　I/R时细胞凋亡的机制尚未完全清楚［6］. Bcl2是抑制凋亡基因，它可以抑制许多刺激诱发的凋亡，而Caspase3激活是I/R损伤发生发展的重要因素，是凋亡发生的标志酶，已经证实它与抗凋亡因子Bcl2，促凋亡因子Bax及Caspase3激活关系密切［7］， 它能激活下游的瀑布式反应，最终导致凋亡［8］. I/R时心肌细胞确实存在Fas抗原mRNA表达水平上调及Bcl2和Bax表达的变化，说明它们参与心肌细胞凋亡的调控. Pio预处理能下调Fas抗原mRNA表达水平并减少Bax，Caspase3蛋白的表达，同时增加抗凋亡因子Bcl2的表达. Pio的这种作用又能被mitoKATP阻滞剂5HD所阻断，推测Pio具有线粒体内膜mitoKATP开放作用.
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