持续动态压应力下骨折愈合时环氧化酶及有关信号分子的表达

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　　　　　　　　 作者：任可 张春才 汪光晔 赵建宁 陆维举 李波

【摘要】 　　目的：探讨持续动态压应力环境对实验性骨折愈合时环氧化酶mRNA表达水平以及前列腺素E2 (PGE2)和环磷酸腺苷(cAMP)含量的影响. 方法：80只新西兰兔行单侧肱骨干横断截骨，实验组以天鹅记忆接骨器内固定，在骨折端造成持续动态压应力，对照组以4孔加压钢板固定. 分别于术后第3， 7， 14， 21， 28， 56， 84日时，在骨折间隙内取材，行组织学、放射免疫和Realtime RTPCR等观察及检测. 结果：环氧化酶2(COX2) mRNA的表达量以及PGE2和cAMP的含量均较骨折前显著上升，且实验组在术后3~4 wk时以上指标明显高于对照组，组织学结果则显示实验组骨折间隙内软骨内成骨和编织骨向板层骨的改建均领先于对照组. 结论：天鹅记忆接骨器产生的持续动态压应力通过COX2，PGE2和cAMP这一信号通路使得成骨细胞分化成熟，促进了骨折愈合.
【关键词】 骨折内固定术； 骨折愈合； 应力； 环氧化酶； 前列腺素E2； 形状记忆合金
　　【Abstract】 AIM: To explore the effect of continuous dynamic pressure stress on cyclooxygenase(COX) mRNA expression and prostaglandin E2 (PGE2) and cAMP contents during experimental fracture healing. METHODS: Unilateral osteotomy of left humeral diaphysis was performed in 80 adult New Zealand rabbits. The humeral fracture was fixed with swanlike memory connector (SMC) in study group and with 4hole dynamic compression plate (DCP) in control group. Samples from the fracture gaps were obtained at 3， 7， 14， 21， 28， 56 and 84 days after operation. The temporal expression patterns of COX mRNA during the repair process were examined through realtime RTPCR. The contents of PGE2 and cAMP were detected through radioimmunity method and the process and quality of fracture healing were observed histologically. RESULTS: The relative levels of COX2 mRNA as well as the contents of PGE2 and cAMP were elevated after fracture， and were significantly higher in study group than those in control group at 3 and 4 weeks postoperatively. Histological observation revealed that the mineralization of cartilage matrix， the endochondral bone formation and the callus remodelling took place earlier in study group. CONCLUSION: The persistent dynamic longitudinal pressure stress produced by SMC may contribute to endochondral bone formation of callus and accelerate fracture healing， which is considered to be closely related with the signaling pathway that has several critical components including COX2， PGE2 and cAMP.
　　【Keywords】 internal fixation; fracture healing; stress; cyclooxygenase; prostaglandin E2; shape memory alloy

　　0 引言
　　骨折愈合是复杂的病理生理过程，并受到生物力学环境的调控. 我们利用镍钛合金的形状记忆效应，根据临床使用的人体肱骨干天鹅型记忆接骨器按比例缩小制成了兔肱骨干的形状记忆接骨器（shape memory connector，SMC）. 该器械的材料性能和几何构型可以保证骨折处的稳定，并在骨折端产生持续动态的压应力［1］. 这与其他内固定物的力学环境明显不同，临床应用显示骨折愈合速度快，成功率高. 本实验考察了兔肱骨干骨折间隙内环氧化酶1(cyclooxygenase1， COX1)、环氧化酶2(cyclooxygenase2， COX2) mRNA的表达情况以及前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)和环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate， cAMP)含量与愈合进程的关系，旨在探讨持续动态压力环境对骨折愈合的影响及可能的机制.
　　1　材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 SMC的制作
　　取含镍50%~53%的镍钛合金板材，厚1.5 mm，依据兔肱骨干中段解剖特征，制成由体部、尾钩、轴向加压支和持骨部组成的SMC. 体部近端宽8 mm，远端宽6 mm，持骨部远、近端内径分别为5 mm和7 mm，内固定器的长度30 mm. 热处理取向单程，形状恢复温度（33±2）℃.
　　将SMC置于0~ 4℃的冰水中降温塑变，持针器展开持骨部，展距略大于骨骼直径. 向背侧拉展加压钩，暂架于体部背侧，复位骨折端并将体部中点对准骨折处，比拟尾钩在近折段处的位置钻孔，置入SMC，再依伸展后的加压钩所在皮质骨处钻孔并插入加压钩， 用40℃~50℃温水复温完成固定［1-2］.
　　1.1.2 兔肱骨干骨折4孔加压钢板的制作兔肱骨干骨折4孔加压接骨板(dynamic compression plate， DCP)及配套螺钉由上海浦卫医疗器械公司制造. 其材料为316 L不锈钢，长、宽、厚分别为38，4和1.6 mm.
　　1.1.3 试剂
　　DRR041S Realtime PCR试剂盒和DRR019A RTPCR试剂盒(TaKaRa公司)；LightCyclerⅡ实时定量PCR扩增仪（Roche公司产品）；兔COX1，COX2和5磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes phosphatedehydrogenase， GAPDH)的引物由北京奥科公司合成，序列如下：COX1：5′ GGC TCG CAG GAG TAC AGC TAC 3′，　　5′ AGG ACG TGG TGG TCA ATG TTC 3′；COX2：5′ TCC CTC ATC TGC AAC AAT GTG 3′，　　5′ GCA GGA CTG TGG GAT TGA TGT 3′；GAPDH：5′ CAC CCA CTC CTC TAC CTT CG 3′，　　 5′ CGT CCT CCT CTG GTG CTC T 3′. PGE2放射免疫分析试剂盒（苏州大学血液研究所产品）；cAMP放射免疫分析试剂盒（上海中医药大学核医学中心提供）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 手术操作
　　成年雄性新西兰兔80只，体质量(2.4±0.3) kg. 25 g/L硫喷妥钠（25 mg/kg）耳缘静脉注射诱导后，400 g/L氯安合剂（氯胺酮/安定 2 mL/kg）腹腔麻醉. 俯卧位消毒铺巾，经外侧切口暴露左侧肱骨干中部，线锯横形截骨. 随机分为实验组和对照组，每组35只. 实验组以SMC内固定，对照组以DCP内固定. 止血、冲洗后关闭切口. 术后分笼饲养，自由活动，并肌注青霉素钠20万U/d，共5 d（图1）. 术后第3，7，14，21，28，56和84日时，每组各处死5只兔，取骨折断端间隙内的骨痂组织留作标本，注意防止RNA酶污染. 另外，两组分别再取5只兔，未经截骨手术即予处死，取其肱骨干中段骨质留作空白对照标本.A: 对照组; B: 实验组.
　　1.2.2 组织学观察
　　术后7~84 d的标本以40 g/L多聚甲醛溶液固定，40 g/L EDTA2Na溶液脱钙，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后连续切片，HE染色，在Olympus BH2光学显微镜下作光镜观察.
　　1.2.3 Realtime RTPCR分析
　　术后3~56 d的标本约每只动物各取50 mg，加入液氮迅速研磨至粉末状，再加入2 mL Trizol，氯仿分离，水相层经异丙醇沉淀，RNA产物溶解于20 μL DEPC处理的双蒸水中. 取总RNA 1 μg，按DRR019A试剂盒说明配制成反转录反应液10 μL，65℃水浴1 min，30℃放置5 min，65℃孵育15 min，98℃灭活逆转录酶5 min，低温保存. 配制PCR反应液：20 μL，内含SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL，上、下游Primer (10 μmol/L)各0.5 μL， RNase Free dh3O 8 μL. 分别取1 μL反转录产物加入含三种引物的PCR反应液中，按以下条件反应：95℃预变性3 min； 95℃ 2 s，56℃ 8 s，72℃ 1 s扩增，循环40次；绘制熔解曲线. 以双ΔCt值法计算两组各时间点COX1和COX2 cDNA模板数与GAPDH的相对值对于骨折前的变化趋势.
　　1.2.4 PGE2和cAMP含量的测定
　　电子天平称取100 mg骨痂标本，加入生理盐水3 mL，电动匀浆，收集上清液，在γ计数器中测量PGE2的放射性强度. 精确称取50 mg骨痂标本， 置入醋酸缓冲液中，电动匀浆，上清吹干后按比例稀释，测定cAMP的放射性强度. 根据标准曲线并计算样本的PGE2和cAMP含量.
　　统计学处理：计量数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行分析，组别和愈合时间的主效应和交互作用以双因素方差分析考察，相同时间点的组间差异行成组t检验. 设定检验水准为0.05.
　　2 结果
　　2.1 组织学观察术后7 d时，两组骨折间隙内均为纤维肉芽组织结构. 14 d时两组骨折间隙内软骨痂均基本形成，软骨基质呈淡蓝色. 相比之下，实验组除软骨痂结构外还在部分区域出现了软骨内骨化现象，骨化前沿的软骨基质发生钙化. 21 d时，实验组已初步形成典型的编织骨结构，骨小梁呈针状或薄片状，小梁中央为偏蓝的钙化软骨基质，周围部分为偏红色的骨组织（图2A）. 而对照组骨折间隙内虽已开始软骨内骨化，但仍有部分区域处于成熟的软骨痂阶段（图2B）. 术后28 d时，两组骨折间隙内均已形成编织骨痂结构，可见很多排列不规则的骨小梁，小梁表面分布着较多成骨细胞. 相对而言，对照组残留的软骨成分更多些，实验组骨小梁中央部位已无蓝染的钙化软骨基质结构. 56 d时，两组骨折端间均为完全的骨性结构，实验组基本成为板层骨结构，骨板沿骨纵轴方向整齐排列，并可见哈佛氏管结构（图3A）. 而对照组板层骨排列的方向性较差，细胞数量也较多（图3B）. 术后84 d时，两组骨折间隙内均完全呈板层骨结构，但对照组骨基质方向仍稍显杂乱.

　　2.2 Realtime RTPCR结果愈合过程中， 实验组和对照组以及各时间点之间COX1 mRNA相对表达量均无统计学意义. COX2 mRNA的相对表达量均有统计学意义， 但组别与愈合时间之间无明显交互作用. 术后3及4 wk时实验组COX2 mRNA的表达量明显高于对照组， 差异具有统计学意义(P&<0.05， 表1)表1COX1 mRNA， COX2 mRNA相对表达量(略)
　　2.3 PGE2和cAMP含量的测定结果显示，两组PGE2的含量随骨折的愈合明显增高，且均在3 wk时达到高峰，然后下降. 除骨折后2 wk时外，PGE2的含量均明显高于骨折前. cAMP含量约在3～4 wk时达到高峰，实验组cAMP含量明显高于对照组，差异具有统计学意义(P&<0.05，表2).
　　3 讨论
　　环氧化酶(cyclooxygenase，COX)包括COX1和COX2两种同工酶［3］. 一般情况下COX1的表达量保持稳定，而COX2的表达则需多种生理刺激的诱导. COX1-/-小鼠的骨折愈合过程与野生型小鼠没有显著差异，而COX2-/-小鼠骨折处间充质细胞滞留，软骨痂基质钙化延迟，骨折愈合受阻［4］，提示COX酶中实为COX2对骨折愈合起着不可或缺的作用［5-6］. 其机理在于COX2合成的PGE2在骨代谢中的重要作用［4］，后者作为信号分子促使间充质干细胞募集、增殖并分化，导致了骨折处的软骨内成骨和膜内成骨［7］. 体外实验证实，PGE2可通过刺激EP2和EP4受体促进MC3T3E1等成骨细胞系的增殖成熟，表现为细胞内cAMP显著增多，然后是ALP活性和I型胶原的合成上升. 因此目前多认为PGE2的成骨作用与第二信使cAMP水平升高密切相关［8］.表2两组骨折标本PGE2， cAMP放免测量值(略)
　　研究显示，信号分子PGE2和cAMP调控骨折愈合的行为受到应力环境的显著影响［9］，一定程度的应变可以促进成骨细胞的增殖分化，同时伴随PGE2含量增加及细胞内cAMP和DNA合成增多. 同样，施加机械负载后成骨细胞内COX2的合成也很快增多［10］. 为此，我们以SMC和DCP在兔肱骨干骨折端制造了不同的应力环境. SMC的体部和持骨部的多点固定保证了愈合骨折端的稳定，加压钩则在骨折端产生持续的纵向压应力，且镍钛合金弹性模量仅为54.18 Gpa，无明显应力遮挡效应，肢体活动时骨端承受的压应力进一步增加，因此骨折间隙始终处在持续、动态的压应力/应变下［1］. 对照组DCP的抗剪、抗旋及抗弯作用很好，骨折端早期非常稳定. 但由于骨折端的吸收和骨组织本身的粘弹性等原因，一段时间后DCP的加压作用会明显消减，而外加载荷大部分经高刚度的不锈钢内固定物承担，骨折端处于应力遮挡状态，骨折间隙内纵向应变很低.
　　我们发现两组骨折间隙内的COX1 mRNA的表达量相对于骨折前无明显变化，且未表现出时相性规律，相同时间点的组间对比也无显著差异，提示COX1在骨折愈合中未发挥明显作用而且其表达量与力学环境无关. 相反，两组术后COX2 mRNA的表达量均较骨折前明显上升，且均在3 wk时达到高峰，时相性规律明显，说明COX2在该骨折愈合模型中发挥重要作用. 又因术后3～4 wk时实验组COX2 mRNA的表达量明显高于对照组，我们推测SMC的应力场可以提高COX2基因的转录水平. 同样，两组PGE2和cAMP均表现出明显的先升高再下降的趋势且总体上cAMP高峰略迟于PGE2，提示PGE2和cAMP也与愈合过程密切相关，且cAMP作为PGE2的第二信使介导成骨细胞的生理反应［8，11］. 骨折后3～4 wk时实验组PGE2和cAMP的含量明显高于对照组，提示SMC的应力场诱导的COX2 mRNA高表达引起了PGE2和cAMP合成增多.
　　国外学者在标准的“解剖复位、坚强固定”的动物骨折模型中发现，全部病理切片中真正表现为一期愈合者最多仅占百分之几，所以一期愈合并非普遍现象. 本实验两组骨折间隙内均为二期愈合过程，原因可能是SMC材质较低的弹性模量和DCP加压作用的减退导致了骨折端一定程度的微动. 相比之下，术后2～4 wk时实验组软骨内成骨和编织骨的形成较对照组提前，8 wk后实验组的板层骨结构也较成熟. 说明SMC的持续动态压应力环境下骨折愈合时软骨基质的钙化、软骨内成骨和编织骨的形成提前，且愈合进程一直领先到板层骨塑形阶段. Brighton等［12］的研究也发现，骨折间隙内的纵向压应力可以驱动软骨基质的矿化和间充质细胞向成骨方向的分化，刺激成骨细胞的功能，并促进骨痂改建. 考虑到本实验中两组的差异主要在于内固定生物力学环境，且COX2 mRNA，PGE2和cAMP的升高恰在骨折端发生软骨内成骨时，我们认为SMC的持续动态压应力诱导了COX2 mRNA的转录， 催化了PGE2的合成， 这些PGE2再作用于特定的受体引起细胞内cAMP增多， 然后经PKA等途径导致了一系列靶基因的转录和表达， 使得成骨细胞迅速分化成熟并提高了细胞的成骨活性， 促进了软骨痂骨化， 加速了骨折愈合.
【参考文献】
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