【摘要】 目的：探讨大鼠重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤与血清、肺组织中P选择素表达的关系及清胰Ⅱ号对肺损伤的保护作用. 方法：将30只Wistar大鼠随机分为对照组、SAP组和清胰Ⅱ号治疗组. 以40 g/L牛磺胆酸钠逆行注入胰胆管制作大鼠SAP并发急性肺损伤模型；造模1 h后将清胰Ⅱ号（6 mL/kg）用于模型，11 h后重复给药1次；造模24 h后取材，采用ELISA方法检测血清及肺组织中P选择素的表达，同时观察血清淀粉酶及胰、肺组织的病理改变. 结果： SAP组有胰、 肺组织损伤改变， 同时血清、 肺组织P选择素浓度由(8.6±1.0) ng/L， 11.42 (P25 11.07， P75 12.92) ng/L分别增高至(34.0±1.4) ng/L，72.47 (P25 57.78， P75 110.97) ng/L. 清胰Ⅱ号可降低血清、肺组织P选择素的浓度，减轻胰、肺组织的病理损伤程度. 结论：P选择素在SAP肺损伤发病机制中可能具有重要作用. 中药清胰Ⅱ号可能通过降低血清和肺组织的P选择素浓度减轻SAP时胰腺和肺组织病理学改变，从而发挥其保护作用.
【关键词】 重症急性胰腺炎；肺/损伤；大鼠；P选择素
【Abstract】 AIM: To study the correlation between the severe acute pancreatitis (SAP) complicated with acute lung injury and the expression of Pselectin in rats serum and pulmonary tissue and the protective effect of Qingyi Ⅱ against the acute lung injury. METHODS: Thirty Wistar rats were randomly pided into control group (n=10)， SAP group (n=10) and Qingyi Ⅱ treatment group (n=10). SAP models were established by injecting 40 g/L sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The Qingyi Ⅱ(6 mL/kg) was injected in the Qingyi Ⅱ group 1 and 12 h after the models were established. All the animals were sacrificed at 24 h. Then， the expression of Pselectin in serum and pulmonary tissue were assayed by ELISA， meanwhile， the pathological changes of pancreas and lung tissues were observed under microscope. RESULTS: The concentrations of Pselectin in serum and pulmonary tissue were lower in normal rats than in SAP rats (P&<0.05)， and the traditional Chinese medicine Qingyi Ⅱ reduced them significantly (P&<0.05). Compared with SAP group， Qingyi Ⅱ group had less pathologic damage in both pancreatic and pulmonary tissues. CONCLUSION: Chinese medicine Qingyi Ⅱ redues the concentrations of Pselectin in serum and pulmonary tissue and alleviate the pathologic damage of the pancreas and lungs in rats with SAP complicated with lung injury， which suggests that Qingyi Ⅱ may play an important role in treating SAP.
【Keywords】 severe acute pancreatitis；lung/injury；rats；P selectin
0 引言
急性重症胰腺炎（severe acute pancreatitis， SAP）是外科临床常见的危重症之一. 近年研究发现，SAP肺损伤时的一个典型特征是中性粒细胞在肺组织中弥漫或广泛浸润［1］，被激活的中性粒细胞诱导释放炎性介质导致肺损伤，而介导中性粒细胞穿越血管内皮屏障形成肺组织浸润的关键是P选择素. 我们通过复制大鼠SAP并肺损伤模型，观察不同处理组肺组织病理改变及血清和肺组织P选择素的浓度变化，以探讨SAP并肺损伤可能的发病机制及中药清胰Ⅱ号对SAP并肺损伤是否有保护作用，为其临床应用提供科学的实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
健康成年Wistar大鼠30只，雌雄不限，体质量(200±50) g（遵义医学院动物饲养中心提供）. 清胰Ⅱ号(遵义医学院研制)，牛磺胆酸钠（美国Sigma公司），Pselectin ELISA试剂盒（大连泛邦化工技术开发有限公司）；全自动生化分析仪（日立7020型）.
1.2 方法
1.2.1 动物分组及制模
将大鼠随机分为对照组、SAP组和治疗组三组，每组10只. 参照文献［2］的方法制备SAP模型：100 g/L氯胺酮 (80 mg/kg) 腹腔注射麻醉动物，上腹正中切口入腹；SAP组和治疗组大鼠开腹后提起十二指肠以小号血管夹分别夹住十二指肠端和肝门部胰胆管，逆行向胆胰管内注入40 g/L牛磺胆酸钠溶液1 mL/kg，注射时间1 min，保持5 min后关腹；对照组大鼠开腹后仅翻动十二指肠后关腹. 术后1 h各组大鼠灌胃：SAP组、对照组喂饲生理盐水，6 mL/kg；治疗组喂饲208 g/L清胰Ⅱ号，6 mL/kg；11 h后重复灌胃1次. 术后24 h活杀取材，检测有关指标.
1.2.2 形态学观察
动物处死后，肉眼观察胰腺和肺脏的外观变化及有无胸腹液. 取各组大鼠十二指肠环内胰腺组织和右肺上叶组织做常规HE染色，镜下观察胰、肺组织病理学变化. 肺组织损伤由专人参照Hofbauer等［3］的方法，采用双盲法进行评分.
1.2.3 血清淀粉酶检测
门静脉取血，室温放置2 h，3000 r/min离心15 min，取上层血清，全自动生化分析仪检测血清淀粉酶活性.
1.2.4 血清P
选择素检测门静脉取血，分离血清，-20℃保存. 按Pselectin ELISA试剂盒的操作方法测定各样品中P选择素的含量.
1.2.5 肺组织P
选择素检测将各组同样质量的肺组织分别超声粉碎，离心后取上清，-20℃保存. 按Pselectin ELISA试剂盒方法测定各样品中P选择素的含量.
统计学处理: 采用SPSS 11.5统计软件进行统计处理和分析，进行方差齐性和正态性检验. 资料呈正态分布且方差齐同者，采用方差分析. 差异有统计学意义者，进一步作两两比较的q检验；偏态分布或方差不齐者，采用秩和检验，将数据经秩转换后作两两比较的q检验，P&<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 形态学观察对照组大鼠胸、腹腔内无积液；SAP组大鼠出现中等量血性胸水，腹腔内有大量腹水，浑浊呈黄色或淡血水性；治疗组大鼠胸腔内见少量血性胸水，腹腔内有少量或中等量腹水，呈淡黄色或淡血水性. SAP组大鼠的胸、腹水量较对照组明显增高，分别由0增加至(0.21±0.26) mL和(8.89±2.16) mL（P&<0.05）；而治疗组大鼠的胸、腹水量较对照组亦明显增高，由0分别增高至(0.09±0.17) mL和(3.52±2.83) mL（P&<0.05）；治疗组大鼠腹水量较SAP组明显降低（P&<0.05），胸水量差异无统计学意义. 胰腺组织病理改变：对照组胰腺腺泡结构完整，组织无水肿、出血、坏死及炎性细胞浸润；SAP组胰腺腺泡破坏，组织水肿，有大片出血及坏死灶，胰腺间质、导管及其周围大量中性粒细胞浸润；治疗组胰腺腺泡结构的破坏、组织水肿、出血及坏死均较SAP组轻，中性粒细胞组织浸润较SAP组减少. 肺组织病理改变：对照组肺组织无水肿、出血、肺不张及炎性细胞浸润；SAP组组织结构紊乱、间质水肿、肺泡腔内及间质出血，大量炎性细胞浸润，灶性或片状肺不张； 治疗组间质水肿、 肺泡腔内及间质出血， 局限性肺不张较SAP组显著减轻， 炎性细胞浸润明显减少.
2.2 其它各项指标检测SAP组大鼠的肺组织损伤评分明显高于对照组（P&<0.01），治疗组的肺组织学损伤程度较SAP组有下降趋势（P&<0.01）. SAP组大鼠血清淀粉酶活性，P选择素浓度及肺组织P选择素浓度均较对照组明显升高（均P&<0.05）；与SAP组相比，治疗组血清P选择素及肺组织P选择素浓度均显著降低（P&<0.05， P&<0.05）， 血清淀粉酶活性差异无统计学意义（表1）.表1清胰Ⅱ号对肺组织损伤评分、血清淀粉酶、血清及肺组织P选择素含量的影响（略）
3 讨论
SAP常伴发一个或多个脏器的功能障碍. 急性肺损伤常发生在SAP的早期，是SAP早期死亡的首要因素. SAP伴发急性肺损伤与继发的肺微血管内的白细胞过度活化有关［4］，活化的白细胞释放大量的炎症介质造成肺组织损害. 而在此过程中，介导白细胞穿越血管内皮屏障形成肺组织浸润导致肺损伤的关键是P选择素［5］.
P选择素是血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白（platelet activation dependent granuleexternal membrane protein， PADGEM）或称为CD62P. 存在于血小板а颗粒及内皮细胞中的WeibelPalade小体中，在正常生理情况下为低水平表达或不表达，而在急性炎症早期，炎症细胞向受损部位趋集过程中表达明显增加，Lundberg等［6］发现，SAP时选择素表达的动态变化与肺部组织学损害相关. 我们的结果表明，SAP组大鼠的胰腺和肺脏中，组织病理检查均发现有大量的多形核白细胞浸润，而在对照组大鼠的以上组织中则偶有多形核白细胞存在；对照组大鼠无论是在血清或在肺组织中，P选择素均处于一种低表达状态，而SAP组血清或肺组织中的P选择素则高表达，两组相比有显著性差异（P&<0.05），表明在SAP发生过程中，大量感染性细胞因子(如TNFα，IL1，IL6等)及氧自由基的产生诱发细胞粘附分子P选择素的表达，导致白细胞，内皮细胞间相互作用， 促进中性粒细胞的聚集、 粘附和渗出， 释放大量活性氧和弹性蛋白酶， 对血管内皮细胞及肺泡上皮细胞产生损害作用. 提示P选择素在SAP并肺损伤的发病机制中有重要作用.
清胰II号中药复方制剂其主要成份含栀子、丹皮、赤勺、大黄等. 兑丹华等［7］的研究表明，清胰II号具有保护胰腺细胞，减轻内毒素血症，防止肠道细菌移位和抑制感染性细胞因子TNFα，IL1，IL6产生和释放的作用，在本次实验中我们发现，治疗组肺间质水肿、肺泡腔内及间质出血，局限性肺不张较SAP组显著减轻，多形核白细胞浸润明显减少，其肺组织学损伤评分较SAP组有下降趋势（P&<0.01）. 同时， 与SAP组相比， 治疗组大鼠血清及肺组织P选择素浓度均显著降低（P&<0.05， P&<0.05）， 提示清胰II号可能通过抑制P选择素在细胞内的表达， 导致多形核白细胞在肺组织内的浸润减少， 从而减轻了肺部损伤.
参考文献
0 引言
急性重症胰腺炎（severe acute pancreatitis， SAP）是外科临床常见的危重症之一. 近年研究发现，SAP肺损伤时的一个典型特征是中性粒细胞在肺组织中弥漫或广泛浸润［1］，被激活的中性粒细胞诱导释放炎性介质导致肺损伤，而介导中性粒细胞穿越血管内皮屏障形成肺组织浸润的关键是P选择素. 我们通过复制大鼠SAP并肺损伤模型，观察不同处理组肺组织病理改变及血清和肺组织P选择素的浓度变化，以探讨SAP并肺损伤可能的发病机制及中药清胰Ⅱ号对SAP并肺损伤是否有保护作用，为其临床应用提供科学的实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
健康成年Wistar大鼠30只，雌雄不限，体质量(200±50) g（遵义医学院动物饲养中心提供）. 清胰Ⅱ号(遵义医学院研制)，牛磺胆酸钠（美国Sigma公司），Pselectin ELISA试剂盒（大连泛邦化工技术开发有限公司）；全自动生化分析仪（日立7020型）.
1.2 方法
1.2.1 动物分组及制模
将大鼠随机分为对照组、SAP组和治疗组三组，每组10只. 参照文献［2］的方法制备SAP模型：100 g/L氯胺酮 (80 mg/kg) 腹腔注射麻醉动物，上腹正中切口入腹；SAP组和治疗组大鼠开腹后提起十二指肠以小号血管夹分别夹住十二指肠端和肝门部胰胆管，逆行向胆胰管内注入40 g/L牛磺胆酸钠溶液1 mL/kg，注射时间1 min，保持5 min后关腹；对照组大鼠开腹后仅翻动十二指肠后关腹. 术后1 h各组大鼠灌胃：SAP组、对照组喂饲生理盐水，6 mL/kg；治疗组喂饲208 g/L清胰Ⅱ号，6 mL/kg；11 h后重复灌胃1次. 术后24 h活杀取材，检测有关指标.
1.2.2 形态学观察
动物处死后，肉眼观察胰腺和肺脏的外观变化及有无胸腹液. 取各组大鼠十二指肠环内胰腺组织和右肺上叶组织做常规HE染色，镜下观察胰、肺组织病理学变化. 肺组织损伤由专人参照Hofbauer等［3］的方法，采用双盲法进行评分.
1.2.3 血清淀粉酶检测
门静脉取血，室温放置2 h，3000 r/min离心15 min，取上层血清，全自动生化分析仪检测血清淀粉酶活性.
1.2.4 血清P
选择素检测门静脉取血，分离血清，-20℃保存. 按Pselectin ELISA试剂盒的操作方法测定各样品中P选择素的含量.
1.2.5 肺组织P
选择素检测将各组同样质量的肺组织分别超声粉碎，离心后取上清，-20℃保存. 按Pselectin ELISA试剂盒方法测定各样品中P选择素的含量.
统计学处理: 采用SPSS 11.5统计软件进行统计处理和分析，进行方差齐性和正态性检验. 资料呈正态分布且方差齐同者，采用方差分析. 差异有统计学意义者，进一步作两两比较的q检验；偏态分布或方差不齐者，采用秩和检验，将数据经秩转换后作两两比较的q检验，P&<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 形态学观察对照组大鼠胸、腹腔内无积液；SAP组大鼠出现中等量血性胸水，腹腔内有大量腹水，浑浊呈黄色或淡血水性；治疗组大鼠胸腔内见少量血性胸水，腹腔内有少量或中等量腹水，呈淡黄色或淡血水性. SAP组大鼠的胸、腹水量较对照组明显增高，分别由0增加至(0.21±0.26) mL和(8.89±2.16) mL（P&<0.05）；而治疗组大鼠的胸、腹水量较对照组亦明显增高，由0分别增高至(0.09±0.17) mL和(3.52±2.83) mL（P&<0.05）；治疗组大鼠腹水量较SAP组明显降低（P&<0.05），胸水量差异无统计学意义. 胰腺组织病理改变：对照组胰腺腺泡结构完整，组织无水肿、出血、坏死及炎性细胞浸润；SAP组胰腺腺泡破坏，组织水肿，有大片出血及坏死灶，胰腺间质、导管及其周围大量中性粒细胞浸润；治疗组胰腺腺泡结构的破坏、组织水肿、出血及坏死均较SAP组轻，中性粒细胞组织浸润较SAP组减少. 肺组织病理改变：对照组肺组织无水肿、出血、肺不张及炎性细胞浸润；SAP组组织结构紊乱、间质水肿、肺泡腔内及间质出血，大量炎性细胞浸润，灶性或片状肺不张； 治疗组间质水肿、 肺泡腔内及间质出血， 局限性肺不张较SAP组显著减轻， 炎性细胞浸润明显减少.
2.2 其它各项指标检测SAP组大鼠的肺组织损伤评分明显高于对照组（P&<0.01），治疗组的肺组织学损伤程度较SAP组有下降趋势（P&<0.01）. SAP组大鼠血清淀粉酶活性，P选择素浓度及肺组织P选择素浓度均较对照组明显升高（均P&<0.05）；与SAP组相比，治疗组血清P选择素及肺组织P选择素浓度均显著降低（P&<0.05， P&<0.05）， 血清淀粉酶活性差异无统计学意义（表1）.表1清胰Ⅱ号对肺组织损伤评分、血清淀粉酶、血清及肺组织P选择素含量的影响（略）
3 讨论
SAP常伴发一个或多个脏器的功能障碍. 急性肺损伤常发生在SAP的早期，是SAP早期死亡的首要因素. SAP伴发急性肺损伤与继发的肺微血管内的白细胞过度活化有关［4］，活化的白细胞释放大量的炎症介质造成肺组织损害. 而在此过程中，介导白细胞穿越血管内皮屏障形成肺组织浸润导致肺损伤的关键是P选择素［5］.
P选择素是血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白（platelet activation dependent granuleexternal membrane protein， PADGEM）或称为CD62P. 存在于血小板а颗粒及内皮细胞中的WeibelPalade小体中，在正常生理情况下为低水平表达或不表达，而在急性炎症早期，炎症细胞向受损部位趋集过程中表达明显增加，Lundberg等［6］发现，SAP时选择素表达的动态变化与肺部组织学损害相关. 我们的结果表明，SAP组大鼠的胰腺和肺脏中，组织病理检查均发现有大量的多形核白细胞浸润，而在对照组大鼠的以上组织中则偶有多形核白细胞存在；对照组大鼠无论是在血清或在肺组织中，P选择素均处于一种低表达状态，而SAP组血清或肺组织中的P选择素则高表达，两组相比有显著性差异（P&<0.05），表明在SAP发生过程中，大量感染性细胞因子(如TNFα，IL1，IL6等)及氧自由基的产生诱发细胞粘附分子P选择素的表达，导致白细胞，内皮细胞间相互作用， 促进中性粒细胞的聚集、 粘附和渗出， 释放大量活性氧和弹性蛋白酶， 对血管内皮细胞及肺泡上皮细胞产生损害作用. 提示P选择素在SAP并肺损伤的发病机制中有重要作用.
清胰II号中药复方制剂其主要成份含栀子、丹皮、赤勺、大黄等. 兑丹华等［7］的研究表明，清胰II号具有保护胰腺细胞，减轻内毒素血症，防止肠道细菌移位和抑制感染性细胞因子TNFα，IL1，IL6产生和释放的作用，在本次实验中我们发现，治疗组肺间质水肿、肺泡腔内及间质出血，局限性肺不张较SAP组显著减轻，多形核白细胞浸润明显减少，其肺组织学损伤评分较SAP组有下降趋势（P&<0.01）. 同时， 与SAP组相比， 治疗组大鼠血清及肺组织P选择素浓度均显著降低（P&<0.05， P&<0.05）， 提示清胰II号可能通过抑制P选择素在细胞内的表达， 导致多形核白细胞在肺组织内的浸润减少， 从而减轻了肺部损伤.