关于三种荧光标记的短双链RNA体外转染特性的比较

　　　　　　　　 作者：马芸，张仁礼，朱志华，闻安民，高军，周灿权，陈系古

【摘要】 　　目的：比较三种不同荧光标记的短双链RNA(siRNA)体外转染特性. 方法：利用脂质体LipofectamieTM2000转染三种荧光标记siRNA入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3，流式细胞仪观察转染效率，普通倒置荧光显微镜观察其淬灭情况，激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布情况. 结果：相同转染条件下三种荧光siRNA进入细胞的速度，细胞内的定位不同，转染效率不同，三种荧光标记的抗淬灭能力也不同. 结论：荧光标记siRNA可以起到良好的示踪作用. 用荧光标记siRNA作为无荧光siRNA的分布和转染效率参照时，要考虑到所选用荧光标记siRNA与无荧光标记siRNA的差异.
【关键词】 荧光标记；siRNA；转染
　　【Abstract】 AIM: To compare the transfection character of three different fluorescently labeled small interfering RNA (siRNA) in vitro. METHODS: Three fluorescently labeled siRNA were transfected with LipofectamieTM2000 into NIH 3T3 cells for monitoring their transfection efficiency with flow cytometry， tracking their delivery with confocal microscopy and checking their photostability with fluorescent microscope. RESULTS: These three fluorescently labeled siRNA varied in intracellular distribution， transfection efficiency and quench speed. CONCLUSION: The fluorescence labeled siRNA helps to tracking the delivery of siRNA in cells. The difference between fluorescently labeled siRNA and unlabeled siRNA should be considered when the fluorescently labeled siRNA is used to study the distribution and transfection efficiency of siRNA.
　　【Keywords】 fluorescence label；small interfering RNA；transfection

　　0 引言
　　化学合成的siRNA可以高效特异地抑制靶基因的表达，不仅是分析基因功能的有力工具且有望成为新型药物［1］，但递送效率低和体内有效性问题仍然是其应用的瓶颈，因此，深入研究其在体内的分布和动力学过程已逐步受到重视［2］. 利用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等方法检测荧光标记siRNA［3］，观察其摄取、分布及代谢情况，借以推断无荧光标记siRNA的转染效率和分布. 然而目前虽有多种商品化无沉默效应的荧光标记siRNA可供选择，但它们的分布和转染效率是否一致尚少见报道. 本研究比较三种常用荧光标记siRNA利用脂质体转染时转染效率、荧光淬灭情况和细胞内分布特点，以探讨应用荧光标记siRNA时需注意的问题.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　三种荧光siRNA分别为：BLOCKiTTM荧光寡聚物(序列未公开)购自Invitrogen公司；FAM notarget siRNA(正义链5′UUCUCCGAACGUGUCACGU3′，FAM标记于5′端)购自广州锐博公司；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA(靶序列 5′AATTCTCCGAACGTGTCACGT3′，正义链3′端3标记Alexa Fluor 546)购自Qiagen公司. 前两种为即用型，后一种按照说明书方法加入退火缓冲液，90℃变性并退火，分装后避光保存于-20℃. 三种荧光siRNA的储备液浓度均为20 μmol/L. 小鼠胚胎纤维细胞系NIH3T3由中山大学实验动物中心细胞库冻存；高糖DMEM培养基和DPBS购自Gibco BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青工程材料研究所；脂质体LipofectamineTM 2000，OptiMEM低血清培养基购自Invitrogen公司；Hochest33342购自美国Sigma公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂.
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养与转染
　　NIH3T3细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清无抗生素高糖DMEM培养基，每孔4×104个细胞接种24孔板，24 h后细胞的汇合度达40％. 用LipofectamineTM 2000转染荧光siRNA，按照说明书操作进行. 不同浓度转染效率时siRNA各组终浓度分别为0.5，5，40，120 nmol/L，LipofectamineTM 2000均为1 μL. siRNA进入细胞速度时转染复合物孵育时间分别为1，2，4，6和24 h，siRNA浓度均为40 nmol/L，每组不同时间重复3次；观察淬灭情况和共聚焦观察细胞内分布时采用40 nmol/L，观察时间为4 h.
　　1.2.2 流式细胞仪检测
　　荧光siRNA转染效率各组细胞用DPBS冲洗2次，0.25 g/L胰蛋白酶消化，用DPBS制成150 μL单细胞悬液，冰上运输，BD FACSAria流式细胞仪检测，CellQuest软件记录分析.
　　1.2.3 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式
　　转染后6 h后将24孔板直接置于倒置荧光显微镜(Leica DMIRE)载物台上观察，cold CCD数码相机Leica Qwin软件照相. 拍第一张照片时间记为0 min，分别于3 min和5 min后不改动成像参数同一位置再拍摄两张，观察荧光淬灭情况.
　　1.2.4 激光共聚焦显微镜观察［4］细胞铺板时24孔板中放灭菌圆形盖玻片，转染后6 h培养液中加入Hoechst 33342(终浓度5 mg/L)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，取出爬片，-20℃预冷丙酮固定10 min，PBS洗3遍，抗淬灭水性封片剂封片. Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜40倍物镜下观察，BLOCKiTTM荧光寡聚物和FAM notarget siRNA使用488 nm激发光和515～540 nm滤片检测；Alexa Fluor 546阴性对照siRNA使用568 nm激发光和575～640 nm检测滤片.
统计学处理： 采用SPSS 13. 0统计软件处理，χ2分析转染效率差异，P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 FCM检测荧光siRNA转染效率
　　每一样品收集2×104个细胞，设定一个单细胞区域P1用于荧光分析. 以未转染的细胞作为空白对照，设定阳性细胞区(P2区)使阴性对照P区细胞数不超过0.1%(图1A). 40 nmol/L siRNA转染4 h时转染效率Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率为(62.7±2.4)%， BLOCKiTTM荧光寡聚物的转染效率为(85.1±5.2)%， FAM notarget siRNA的转染效率为(69.4±3.6)%. χ2分析示Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率显著低于BLOCKiTTM荧光寡聚物(P=0.037)，BLOCKiTTM荧光寡聚物的转染效率显著高于FAM notarget siRNA的转染效率(P=0.017)，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA的转染效率低于FAM notarget siRNA BLOCKiTTM荧光寡聚物(P=0.000). 随着siRNA浓度增加(图1B)和转染复合物孵育时间延长(图1C)，三种荧光标记siRNA的转染效率增加， 6 h和24 h转染效率相差不大， 唯FAM notarget siRNA 24 h转染效率为(59.3±2.5)%. BLOCKiTTM荧光寡聚物在0.5 nmol/L和5 nmol/L浓度时，转染效率就达FAMsiRNA (27.9±2.5)%和(77.3±3.7)%，孵育1 h和2 h转染效率达(54.1±4.9)%和(78.2±3.6)%，高于其它两种(P=0.000).
　　2.2 普通荧光显微镜观察淬灭情况和细胞内分布模式
　　三种荧光siRNA在普通荧光显微镜下的荧光模式不同. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA倾向于以较大颗粒分布在核周胞浆内(图2A， B， C， D)；BLOCKiTTM荧光寡聚物胞浆、胞核中都有，在胞核中的荧光强度很高(图2E， F， G， H)；FAM notarget siRNA为细小点状荧光信号，分布于胞浆和胞核中(图2I， J， K， L). 用荧光显微镜照射3 min(图2C， G， K)和5 min(图2D， H， L)发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA抗淬灭能力最高，BLOCKiTTM荧光寡聚物居中，FAM notarget siRNA最低，3 min已几乎完全淬灭. BLOCKiTTM荧光寡聚物胞浆中的荧光信号先淬灭，而后是胞核中的. 无siRNA只加LipofectamineTM 2000转染试剂的细胞未见荧光(结果未显示).

　　2.3 激光共聚焦显微镜观察三种荧光siRNA细胞内定位40 nmol/L各种siRNA转染后4 h，Alexa Fluor 546阴性对照siRNA为点状的荧光，多数位于近核胞浆中(图3A，D)；BLOCKiTTM荧光寡聚物(图3B，E)和FAM notarget siRNA(图3C，F)的模式相似，在核内和胞浆中都可见，部分呈荧光颗粒.
　　3　讨论
　　脂质体转染是体外导入化学合成siRNA的标准方法，siRNA体外转染实验报道中使用最多的转染试剂是LipofectamineTM 2000，对许多细胞可以获得很高的转染效率和基因沉默效率［3］，所以本研究也选用该试剂作为转染试剂比较三种荧光标记siRNA的体外转染特性.
　　本实验发现在相同的转染条件下，三种荧光siRNA的转染效率不同；BLOCKiTTM荧光寡聚物更易进入细胞，原因可能因为它的核糖骨架经过磷硫酰化修饰［5］，所以其进入细胞的速度明显增加. 转染6 h和24 h的效率相差不大，可见LipofectamineTM 2000推荐4 h和6 h更换转染复合物比较合理，但注意到Alexa Fluor 546阴性对照siRNA 4 h和6 h的转染效率相差仍比较明显，所以6 h更换转染复合物更加合适. FAM notarget siRNA 24 h转染效率降低为59.3%，原因可能是荧光素淬灭而非转染效率低.
　　关于淬灭情况：标记siRNA的荧光物质有许多种，最早有荧光素(fluorescein，FAM)，后来的藻红素(cy系列)，alexa系列的荧光稳定性和可选择波长更进了一步. 本研究三种荧光siRNA中荧光素FAM notarget siRNA采用的是FAM标记，BLOCKiTTM荧光寡聚物采用的FITC，似乎都为荧光素，但后者经磷硫酰化修饰，稳定性增强，所以其抗淬灭能力也有所增强. Alexa Fluor 546阴性对照siRNA采用的是Alexa fluor546，其中Alexa fluor546标记的siRNA的抗淬灭能力最强.
　　关于细胞内的定位：脂质体转染情况下，siRNA脂质体复合物首先沉积并粘附于细胞表面，然后通过胞吞作用进入细胞形成内含体，在胞浆中通过动力蛋白驱动定向运送到核周区，并迅速在核周区聚集［6］， 最后siRNA从脂质体复合物中释放出来才能发挥作用. 本研究中用共聚焦显微镜观察发现Alexa Fluor 546阴性对照siRNA几乎只以颗粒状分布于近核胞浆中，与Chiu等［3］报道的用LipofectamineTM 2000转染cy3标记的siRNA结果一致，而BLOCKiTTM荧光寡聚物和FAM notarget siRNA在核内和胞浆中都有，在胞浆中核周区可见大的荧光颗粒. 其中BLOCKiTTM荧光寡聚物的核定位考虑与其磷硫酰化修饰有关，而FAM notarget siRNA为正义链5′标记，其核定位可能为与其复合物中混合有单链siRNA有关. Ohrt等［7］显微注射荧光标记的siRNA入Hela细胞的胞浆中，发现双链siRNA不能进入细胞核，而单链siRNA有明显聚集于核内的倾向. 而Alexa Fluor 546阴性对照siRNA未于见核中可能因为siRNA还未从脂质体复合物中释放. 而siRNA从复合物中释放是与基因沉默效果相关的，是否说明荧光标记影响基因沉默效果还有待分析.
　　综上所述，选取合适的荧光标记siRNA作为转染效率评估指标和用于细胞内分布研究时，要注意荧光标记物对siRNA的影响，以及靶向目的基因的siRNA与所选用荧光标记的对照siRNA在化学修饰等因素方面的相似性.

参考文献

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