关于三氮唑席夫碱衍生物对人肝癌细胞SMMC 7721的诱导分化作用

　　　　　　　　　　 作者：马永超，皇甫超申，胡国强，杨锐生，刘彬

【关键词】 三氮唑席夫碱衍生物； 肝细胞癌； 细胞增殖； 细胞分化
　　【Abstract】 AIM: To study the effect of 3pyridin3yl4［（4hydroxy3methoxybenzylidene）amino］5methylsulfanyl4H［1，2，4］ triazole (LH37) on the induction of differentiation of hepatocarcinoma SMMC7721 cells. METHODS: SMMC7721 cells were cultured in RPMI1640 and treated by LH37 at different doses. The proliferation of the cells was examined by MTT assay. Cell morphology was observed by light microscopy. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to detect the changes of alpha fetoprotein (αFP) mRNA. The specific activities of alkaline phosphatase (ALP) were assayed by ALP kit based on Kings method. RESULTS: The cell proliferation was inhibited by LH37 at 1×10-5-1×10-3 mol/L in dose dependent manners. 1×10-5 mol/L LH37 induced the morphological normality of SMMC7721 cells. After treated with 1×10-5 mol/L or 1×10-6 mol/L LH37， the mRNA expression of αFP was significantly reduced and the activities of ALP were remarkably declined (P&<0.01). CONCLUSION: LH37 may inhibit proliferation and induce differentiation of human hepatocarcinoma SMMC7221 cells.
　　【Keywords】 triazole schiff base derivative；hepatocarcinoma；cell proliferation; cell differentiation
　　0 引言
　　三氮唑类衍生物具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化的作用［1-2］，但含杂环席夫碱类的该衍生物目前少见报道. 经结构修饰，我们得到了新的三氮唑席夫碱衍生物-LH37. 本研究利用人肝癌SMMC7721细胞株，初步探讨该化合物对癌细胞增殖和诱导分化的影响，希望获得能够诱导肿瘤细胞分化的候选物，为进一步开发和应用提供依据.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 诱导剂LH37是具有1，2，4三氮唑骨架结构的3吡啶3基4［（4羟基3甲氧基苯亚甲基）氨基］5甲硫基1，2，4三唑（图1），由河南大学药物研究所提供. 纯度&>99%，二甲基亚砜（DMSO）溶解.
　　1.1.2 细胞株和主要试剂
　　肝癌细胞株SMMC7721（中国医学科学院基础医学研究所）生长在含100 mL/L胎牛血清（天津灏洋生物制品公司）的RPMI 1640培养基（ Gibco公司）中.四甲基偶氮唑蓝（MTT），MMLV逆转录酶，Oligo(dt)15和RNasin (Promega公司)；DMSO (Solarbi公司)；维甲酸（RA）(美国Sigma公司)；金氏法碱性磷酸酶检测试剂盒(北化康泰试剂有限公司). 其余试剂为国产分析纯.
　　1.1.3 引物合成甲胎蛋白(αFP)和βactin引物序列引自文献［3，4］， 均由上海生工生物工程公司合成.
　　1.2 方法
　　1.2.1 MTT试验
　　细胞以1×104/L接种到96孔细胞培养板，0.2 mL/孔，继续培养24 h后换液，同时加入LH37. LH37按倍比稀释方式加入，最高浓度为1.024×10-3 mol/L，最低浓度为1.6×10-5，共7个浓度梯度（每个浓度5个复孔），对照组只加培养液. MTT试验按照文献［5］的方法进行.
　　1.2.2 形态学观察
　　SMMC7721细胞以1×105/L浓度接种于含盖玻片的6孔培养板中培养24 h，1×10-5 mol/L LH37处理细胞96 h后取出盖玻片，瑞氏染色，显微镜观察，对照组只加培养液.
　　1.2.3 αFP mRNA表达检测
　　SMMC7721细胞培养至对数生长期加入各种药物，其中用1×10-5 mmol/L RA作为阳性对照；用DMSO（与LH37等体积）排除溶剂的干扰作用；LH37选用1×10-5 mol/L和1×10-6 mol/L两个浓度；阴性对照组不加药. 继续培养48 h弃去培养液，采用异硫氰酸胍酸性酚氯仿抽提法提取总RNA. 逆转录合成cDNA第一链，直接用于PCR扩增. 人αFP上下游引物序列分别为5′ATTCAGACTGCTGCAGCCAA3′和5′GTGCTCATGTACATGGGCCA3′，PCR产物为475 bp. βactin上下游引物序列分别为5′GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC3′和5′TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT3′，PCR产物为516 bp. 反应条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共进行35个循环.
　　1.2.4 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定
　　细胞按1×104/L浓度接种， 培养24 h后各组细胞分别按1×10-6 mol/L和1×10-5 mol/L浓度加入LH37，阳性对照组按1×10-5 mol/L浓度加入RA，继续培养48 h后消化并收集细胞，按每1×106个细胞加放射免疫沉淀裂解液（RIPA） 2 mL，剧烈振荡30 s，转移入2 mL EP管. 4℃ 12 000 g离心20 min，吸取上清液，考马斯亮蓝G250法定蛋白浓度，按试剂盒操作步骤检测ALP活性，每组重复测定3次.
　　统计学处理： 数据均用x±s表示， 应用SPSS 12.0软件包处理， P&<0.05为差异具有统计学意义. 所用统计分析方法有单因素方差分析（多重比较采用Dunnett检验），成组t检验.
　　2 结果
　　2.1 LH37对SMMC7721细胞增殖的抑制作用
　　不同浓度LH37作用48 h对肝癌细胞具有增殖抑制作用，抑制率与药物浓度正相关（相关系数0.9052），呈剂量依赖关系， IC50为2.0×10-4 mol/L， IC30为6.9×10-5 mol/L（表1）.表1MTT比色法检测LH37对SMMC7721细胞增殖的影响(略)
　　2.2 LH37对SMMC7721细胞形态变化的影响
　　对照组SMMC7721细胞贴壁生长良好， 并有肿瘤细胞的典型形态，细胞间相互连接，密集成片生长，细胞核大，核浆比大，有3~6个核仁，细胞浆内无空泡（图2A）. LH37 (1×10-5 mol/L)处理组作用48 h后可见部分细胞脱落， 贴壁细胞浆内颗粒多，表现为细胞体积变小，呈三角形、梭形或多边形，核明显变小，核浆比减少，核仁1~2个，胞浆有圆形空泡，呈现向正常细胞形态逆转演变的特征(图2B).
　　2.3 LH37对SMMC7721细胞αFP mRNA表达的影响

　　LH37处理组αFP mRNA表达量明显低于对照组，说明LH37作用48 h对SMMC7721 细胞αFP mRNA表达量有抑制作用，其中LH37(1×10-5 mol/L)处理组诱导SMMC7721细胞αFP mRNA表达量明显低于LH37( 1×10-6 mol/L)处理组. RA和DMSO（1×10-5 mol/L）对SMMC7721 细胞αFP mRNA表达也有抑制作用(图3).
　　2.4 LH37对SMMC7721细胞ALP酶活性的影响
　　经LH37和维甲酸处理的SMMC7721细胞ALP酶活性均有不同程度的提高. LH37（1×10-6 mol/L)处理组比对照组提高24.98% ［（1.131±0.033） vs （0.830±0.032）， P&<0.01］， LH37（1×10-5 mol/L)处理组比对照组提高15.69% ［（1.019±0.062） vs （ 0.830±0.032）， P&<0.05］，而RA（1×10-5 mol/L)处理组比对照组提高20.09% ［（1.072±0.027） vs （ 0.830±0.032）， P&<0.01］.
　　3 讨论
　　应用MTT 比色法定量测定化合物对癌细胞的生长抑制程度已成为抗癌药物筛选的常规基础手段. LH37作用48 h能抑制SMMC7721细胞的生长，且抑制作用具有药物浓度依赖性. 随着LH37浓度的升高， 对细胞的抑制作用增强. 提示LH37可以直接作用于SMMC7721细胞， 有显著的细胞增殖抑制作用.
　　
　　形态学上的分化成熟是表明恶性肿瘤细胞分化的标志. 肝癌细胞分化不良在形态学上主要表现为细胞增大深染、核大、核仁多、呈多型性等. 而核、浆比例失常是区别癌变肝细胞和肝细胞良性增生的主要根据. 在培养人肝癌细胞中加LH37后，发现细胞形状趋向规则，核明显变小，核仁明显减少，核浆比减小，表明结构上趋向分化的改变，这一过程与人胎肝干细胞的体外培养及诱导分化部分相似［6］.
　　
　　αFP是公认的肝细胞增殖和恶变的重要标志物. LH37诱导后细胞内αFP mRNA 表达明显下降，作用效果类似RA. ALP除作为畸胎瘤和胰腺癌细胞的分化标志外［7］，在多种具有分化诱导作用的化合物作用下，肝癌细胞的ALP活性亦可明显增高［8］. 本研究选用ALP作为肝癌细胞分化的功能指标，结果显示LH37诱导后ALP活性升高， 与RA作用一致. 三氮唑席夫碱衍生物诱导肿瘤细胞分化的作用机理尚不清楚，氨基均三唑类化合物可明显提高肿瘤细胞SOD活性并降低过氧化氢酶活性，使细胞内h3O2含量升高，从而推测三氮唑席夫碱衍生物诱导肿瘤细胞分化的作用可能与h3O2作用有关［9］.
　　综上所述，本研究应用肝癌细胞分化的不同指标，揭示了LH37具有显著抑制人肝癌细胞增殖和诱导分化的作用. LH37是一种潜在的癌细胞分化诱导剂，其抗肿瘤作用具有一定的研究和应用前景.

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