关于组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A联合全反式维甲酸诱导PLZFRARα阳性U937细胞分化

　　　　　　　　　　 作者：陈思宇　马立恒　董颖　贾培敏　陈丽娟　郑磊贞　王振义

【摘要】 目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)和全反式维甲酸(ATRA)对PLZFRARα阳性细胞的作用. 方法：稳定转染PLZFRARα基因的U937细胞(U937/PLZF)经TSA， ATRA作用一段时间后，WrightGiemsa染色观察细胞形态，MTT法检测细胞生长和增殖状态，流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面分化抗原CD11b，CD64，CD14等的表达，荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达，细胞化学染色和硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况. 结果：U937/PLZF细胞在去除四环素条件培养后，PLZFRARα表达明显增加. TSA (30 μg/L)联合ATRA (1 μmol/L)使U937/PLZF细胞核质比缩小，生长增殖受抑，S期细胞减少，CD11b表达增高，PLZFRARα蛋白表达减弱，分布以胞核弥漫细小颗粒为主，细胞功能上的分化可能尚不成熟. 结论：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使U937/PLZF细胞发生部分分化.
【关键词】 PLZF；维甲酸；组蛋白去乙酰化酶；分化；白血病，早幼粒，急性
　　【Abstract】 AIM: To investigate effects of alltrans retinoic acid (ATRA) and trichostatin A (TSA)， a histone deacetylase inhibitor， on PLZFRARαpositive cells. METHODS: PLZFRARαpositive U937 cells (U937/PLZF) were used as an in vitro model. The change of cell morphology was observed by WrightGiemsa staining， cell growth and proliferation were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay， cell cycle distribution and expression of cell membrane surface differentiationrelated antigens (such as CD11b， CD64 and CD14) were determined by flow cytometry assay. Expression of PLZF was analyzed by immunofluorescence. Functional differentiation was reflected by nitroblue tetrazolium (NBT) reduction ability and cytochemical staining. RESULTS: While U937/PLZF cells were incubated in tetracyclinewithdrawn medium， the expression of PLZFRARα protein was increased. After treated with TSA (30 μg/L) and RA(1 μmol/L)， U937/PLZF cells presented morphologically some features of differentiated cells. The cell growth and proliferation were inhibited in a dose and timedependent manner. The number of cells in S phage was decreased and the level of CD11b was increased. The expression of PLZF relocated in treated cells. However， no significant difference in NBT assay and cytochemical staining was documented with the combination therapy. CONCLUSION: The combination of histone deacetylase inhibitor TSA with ATRA can cause partial differentiation of PLZFRARα positive U937 cells.

　　【Keywords】 PLZF；RA；histone deacetylase；differentiation； leukemia， promyelocytic， acute
　　0引言
　　1980年代中期， 我国学者率先应用全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia， APL)， 缓解率高达85%~90%. 但是仍有一部分患者对ATRA不敏感，预后较差. 研究发现， 约1% APL患者携带t(11;17) (q23;q21)，表达PLZFRARα融合蛋白，对化疗不敏感，单用ATRA不能诱导缓解，已知PLZFRARα的PLZF端能与包括组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase， HDAC)在内的转录共抑制复合物紧密结合.我们以PLZFRARα转染细胞为模型，研究了HDAC抑制剂(HDACi)曲古菌素A(trichostatin A， TSA)联合ATRA对PLZFRARα阳性白血病细胞的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　U937细胞和稳定转染PLZFRARα基因的U937细胞(U937/PLZF)系保存细胞株［1］， 后者培养液中维持添加0.5 mg/L嘌呤霉素(puromycin， Sigma)， 0.1 mg/L四环素(tetracycline， Sigma)和1 g/L G418 (Sigma). 实验前撤去四环素，以诱导PLZFRARα蛋白表达. 细胞离心涂片，WrightGiemsa染色观察细胞形态. TSA(Sigma)溶解于无水乙醇，配成1 g/L储存液， 用时以培养液稀释成10 mg/L工作液. ATRA(Sigma)溶解于无水乙醇， 配成10 mmol/L储存液， 用时以培养液稀释成100 μmol/L工作液.
　　1.2方法
　　1.2.1MTT法检测细胞生长按照文献［2］方法操作，570 nm处测A值. 细胞生长抑制率=（1-处理组平均A值/对照组平均A值）×100%. 重复3次取平均值.
　　1.2.2流式细胞仪检测细胞周期及凋亡取约1×106细胞，冷乙醇固定，Rnase (终浓度200 mg/L)消化，20 mg/L碘化丙啶(PI)染色30 min，用流式细胞仪(BeckmonCoulter)检测细胞不同DNA含量分布，经Multicycle软件分析细胞周期和凋亡细胞.
　　1.2.3检测细胞表面分化抗原取细胞悬液100 μL（约含5×105细胞），加入FITC或PE标记的鼠抗人CD11b，CD64，CD14 mAb和相应的同型抗体（同种荧光标记的非特异性鼠抗人IgG1，IgG2α）（均购自CoulterImmunotech， France），室温下避光孵育30 min，PBS清洗，重悬细胞，立即进行流式细胞仪检测.
　　1.2.4检测融合蛋白表达细胞涂片，-20℃预冷甲醇/丙酮(1∶1)固定液浸泡固定5~10 min， PBS浸洗，30 g/L BSA封闭，一抗(goat antiPLZF， Santa Cruz)室温孵育1 h，PBS洗5 min×5次，二抗(FITCrabbit antigoat IgG) 室温孵育1 h，PBS洗5 min×5次，PI复染，封片，激光共聚焦显微镜下观察.
　　1.2.5细胞化学染色氯乙酸ASD萘酚酯酶染色(CE)， 醋酸ASD萘酚酯酶染色(AE)， 过碘酸席夫试验（糖原染色，PAS）， 过氧化物酶染色(POX)，按照常用方法进行.
　　1.2.6硝基蓝四氮唑还原试验取约1×106细胞，PBS清洗后加入硝基蓝四氮唑(NBT)反应液，37℃孵育30 min，混悬细胞，离心(500 r/min×5 min)涂片，光镜下计数阳性细胞率，每个视野至少计数200个细胞.
　　2结果
　　U937/PLZF细胞在添加0.5 mg/L嘌呤霉素(puromycin)， 0.1 mg/L四环素(tetracycline)和1 g/L G418培养液中维持培养，PLZFRARα呈低水平表达. 撤去四环素后，PLZFRARα的表达明显增加.
　　2.1细胞形态学变化单独使用TSA(30 μg/L)或ATRA (1 μmol/L)处理表达PLZFRARα的U937/PLZF细胞，24~72 h形态变化不甚明显；当二者合用时，细胞核质比明显缩小，核仁减少但未完全消失（图1）.
　　2.2TSA和ATRA抑制U937/PLZF细胞的生长10~30 μg/L TSA对U937细胞的增殖几乎没有抑制作用，但对U937/PLZF细胞的增殖有抑制作用，此作用呈现时间剂量的依赖性. 1 μmol/L ATRA对U937/PLZF细胞增殖的抑制作用较弱， 3 μmol/L ATRA的抑制作用则明显增强. TSA和ATRA合用可以明显抑制U937/PLZF细胞增殖(表1). 另外，我们还发现另一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂PB对U937/PLZF细胞作用较弱(低于20%)，与ATRA合用后抑制作用也有增强.表1TSA或TSA合用1 μmol/L ATRA对U937/PLZF细胞的生长的抑制率（略）
　　2.3细胞周期和表面抗原的变化TSA作用后，U937/PLZF细胞周期阻滞在G1期，S期细胞明显减少. 1 μmol/L ATRA也能使S+G2期细胞明显减少，并出现亚二倍体(SubG1)峰. 1 μmol/L ATRA作用后，U937/PLZF细胞的CD11b表达略有增高，30 μg/L TSA使其表达增高的程度明显强于ATRA，二者合用有较弱的协同作用. 同时可见，CD64表达的变化不明显. CD14 在U937/PLZF细胞表达量极低，加药处理后未看到明显变化. 未诱导表达PLZFRARα的U937/PLZF细胞经过1 μmol/L ATRA或者10~30 μg/L TSA处理后，细胞表面CD11b表达增高；而在诱导PLZFRARα高表达后，其对ATRA处理的反应性减弱，对TSA处理反应性明显增强. 结合前面观察到的10~30 μg/L TSA对U937细胞的增殖几乎没有抑制作用但对U937/PLZF细胞有抑制作用，说明PLZFRARα的表达可以增强细胞对TSA的敏感性.

　　2.4PLZF蛋白的变化培养液中撤除四环素后，U937/PLZF细胞的PLZFRARα表达增强，但分布似以胞质为主，胞核内弥漫细小颗粒分布. TSA合用ATRA处理后，PLZFRARα表达减弱，分布以胞核弥漫细小颗粒为主.
　　2.5细胞化学染色药物作用4 d后进行细胞的化学染色，粒细胞特异性酯酶(CE)未出现阳性，表明细胞仍以单核系为主，RA或TSA+RA处理组AE的氟化钠(NaF)抑制率有所下降(表2)，提示U937/PLZF细胞有向粒系分化的趋势，但这种趋势很弱.表2U937/PLZF细胞经30 μg/L TSA和1 μmol/L ATRA处理4 d后细胞化学染色(略)
　　2.6NBT还原试验对照组阳性细胞率低于1%，药物处理后阳性率有所增高，最高可达10%左右. 提示细胞功能上的分化可能尚不成熟.
　　3讨论
　　组蛋白的乙酰化和去乙酰化与基因调控的研究为人们提供了一个基于染色质靶向治疗肿瘤的新思路，即通过抑制HDAC活性抑制肿瘤. 目前人们已经研究发现了多种HDACi［3］，如：正丁酸，丙戊酸，TSA，trapoxin (TPX)， SAHA，已知TSA对各种实体瘤和白血病细胞均有明显的抗癌作用［4］，可以加强维甲酸诱导PLZFRARα APL细胞分化的作用［5］. 我们发现，PLZFRARα阳性U937细胞对维甲酸不敏感，而联合应用TSA和维甲酸后，细胞的生长增殖受到抑制，核浆比例缩小，细胞表面CD11b表达增高，表明细胞发生了分化的趋向，这提示TSA加强了维甲酸的诱导分化作用.
　　
　　组蛋白乙酰化是转录的一个重要步骤，可以使组蛋白DNA结合松解，而使得各种因子容易接近DNA. 许多转录的抑制子和共抑制物都可以募集HDAC复合物到启动子区. t(11;17)(q23;q21)APL涉及的PLZF及RARα信号通路参与了生物发育，细胞的增生，分化及凋亡等多种生物学功能. PLZF通过BTB/POZ募集SMAT，NCoR，HDAC等核共抑制复合物，构成了一个调节造血细胞正常发育和参与白血病发生的网络. 有报道PLZF是RARα转录活性的负性调控子［6］. RARα信号通路所调控的基因失调是APL发生的共同点. RARs通过与共抑制子/共激活物相互作用来调控基因的转录，在调节造血细胞成熟尤其是髓系分化中起重要作用. PLZFRARa融合蛋白来源于PLZF的POZ功能域和前2或3个锌指，以及RARa基因的大部分功能域（B~F功能域）. 与PMLRARα相似，PLZFRARα能以同二聚体的方式结合到RARE上，或经POZ功能域与PLZF或经RARα部分与RXR形成异二聚体， 改变DNA结合和转录活性，干扰正常的PLZF蛋白功能以及RARαRXRRA途径. 药理浓度ATRA仅能诱导RARα部分的E区与NCoR解离，而PLZF部分的POZ结构域仍与CoR紧密结合，转录依然受到抑制. 再加用HDACi如TSA等，可直接消除POZ位点上结合的NCoR复合物，使核小体组蛋白解除去乙酰化作用，其下游基因的转录作用得以恢复正常.
　　在本研究中，U937/PLZF细胞有向粒系分化的趋势，这种趋势很弱. 细胞核仁减少但是并未完全消失，提示细胞的分化还不是很完全. 这有待于延长加药时间重复实验并借助于其它细胞功能分化标志进行判断.
基金项目：国家自然科学基金面上项目（30300139）;上海市博士后科研资助计划（200316）;上海市教委重点项目（07zz43）
【参考文献】
　　［1］Ward JO， McConnell MJ， Carlile GW， et al. The acute promyelocytic leukemiaassociated protein， promyelocytic leukemia zinc finger， regulates 1，25dihydroxyvitamin D3induced monocytic differentiation of U937 cells through a physical interaction with vitamin D3 receptor ［J］. Blood， 2001， 98(12): 3290-3300.

　　［2］陈思宇， 刘陕西， 李信民. 硫化砷诱导K562细胞凋亡中Bcl2和Bax的表达［J］. 第四军医大学学报， 2002， 23(9):790-792.

　　［3］Petrie K， Prodromou N， Zelent A. Histone deacetylase inhibitors in APL and beyond［J］. Curr Top Microbiol Immunol， 2007， 313: 157-203.

　　［4］Bolden JE， Peart MJ， Johnstone RW. Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors［J］. Nat Rev Drug Discov， 2006， 5(9): 769-784.

　　［5］Petti MC， Fazi F， Gentile M， et al. Complete remission through blast cell differentiation in PLZF-RARa-positive acute promyelocytic leukemia: in vitro and in vivo studies［J］. Blood， 2002， 100(3): 1065-1067.

　　［6］Martin PJ， Delmotte MH， Formstecher P， et al. PLZF is a negative regulator of retinoic acid receptor transcriptional activity ［J］. Nucl Recept， 2003， 1(1): 6.