关于食管鳞癌中zac基因的表达及临床意义

　　　　　　　　 作者：祁秋干，马军，达嘎，闫尧，唐芙爱，李印

【摘要】 　　目的：观察zac基因在食管癌中的表达及意义. 方法：采用RTPCR检测36例食管鳞状细胞癌组织，相应的癌旁组织和远癌组织中zac mRNA的表达情况. PCR产物经凝胶电泳，比较3种组织中zac与GAPDH条带的灰度值之比，半定量分析zac mRNA的表达水平. 结果：36例食管癌组织中有14例(38.9%) zac mRNA检测到阳性表达，22例(61.1%) zac mRNA表达缺失，其阳性表达低于相应的癌旁组织（85.5%）和远癌组织(100.0%， P&<0.05)；食管癌组织中zac mRNA阳性表达水平(0.38±0.13)低于相应的癌旁组织(0.72±0.16)和远癌组织(0.80±0.12)；随着肿瘤分化程度的升高，zac mRNA在食管癌组织中的阳性表达率也增加(P&<0.05)；zac mRNA阳性表达率在无淋巴结转移的癌组织中显著高于有淋巴结转移者(P&<0.05)，而临床病理分期和病理类型比较差异无统计学意义(P&>0.05). 结论: zac mRNA在食管癌组织中存在表达缺失和低表达，说明zac基因在食管癌的发生发展中可能具有抑癌基因作用，可能与食管癌的转移密切相关.
【关键词】 zac基因；食管肿瘤；mRNA；逆转录多聚酶链反应
　　【Abstract】 AIM: To study the expression of zac gene in esophageal squamous cell carcinoma and its significance. METHODS: The expression of zac gene was detected by RTPCR in 36 cases of esophageal cancer tissues， matched paracancer tissues and tissues far away from tumor. PCR products were tested by gel electrophoresis. The expressions of zac gene in the three kinds of tissues were semiquantified by calculating the ratio of zac and GAPDH gray value of bands respectively. RESULTS: The positive expression rate of zac mRNA in 36 cases of esophageal carcinoma was 38.8% (14/36)， the negative expression rate of zac mRNA was 61.1% (22/36). The positive rate was lower than that in tumoradjacent tissues (80.5%) and esophageal mucosa far away from tumor (100.0%)， respectively (P&<0.05). Semiquantified analysis showed that the expression level of zac mRNA in esophageal cancer tissues (0.38±0.13) was lower than that in tumoradjacent tissues (0.72±0.16) and esophageal mucosa far away from tumor (0.80±0.12). The higher positive expression rate of zac mRNA was correlated with higher differentiation grades in cancerous tissues (P&<0.05). The positive rate of zac mRNA expression was higher in cancerous tissues without lymph node metastasis than in cancerous tissues with lymph node metastasis (P&<0.05)， but it was not correlated with TNM stages and histologic types of tumor (P&>0.05). CONCLUSION: The expression of zac mRNA is lost or reduced in esophageal cancer tissues， which indicates that the zac gene may play a major role in suppressing the tumorigenesis and development in esophageal cancer， and that it may be correlated with metastasis of esophageal carcinoma.
　　【Keywords】 zac gene; esophageal neoplasms; mRNA; RTPCR
　　0 引言
　　zac基因位于人类染色体6q24q25［1］，该基因编码能够诱导细胞凋亡和控制细胞周期进程的锌指蛋白. 目前在大部分乳腺癌、卵巢癌、非功能性垂体腺瘤及头颈部鳞状细胞癌中均可检测到zac mRNA表达缺失或表达下调［2-5］. 而对食管癌组织zac基因的研究，迄今还少见报道. 我们应用RTPCR检测zac基因在食管癌组织中的表达情况，旨在探讨zac基因在食管癌发生、发展中的意义.
　　1 对象和方法
　　1.1 对象
　　河南省肿瘤医院胸外科200603/200608行手术切除的食管癌住院患者36(男26，女10)例，年龄62.2±7.2 (40～75) 岁. 所有患者术前均未接受化、放疗，肿瘤组织经病理学检查证实均为鳞状上皮细胞癌. 临床分型：溃疡型21例(58.3%)，髓质型9例(25.0%)，蕈伞型5例(13.9%)，缩窄型1例(2.8%). 分化程度：高分化4例(11.1%)，中分化8例(22.2%)，低分化24例(66.7%). 临床分期：按国际UICC (1997年)TNM分期：I期4例(11.1%)， Ⅱa期12例(33.3%)， Ⅱb期3例(8.3%)，Ⅲ期17例(47.2%)，Ⅳ期0例. 有淋巴结转移19例(52.8%)，无淋巴结转移17例(47.2%). 主要试剂和仪器：TRIzol总RNA提取试剂（北京TIANGEN公司)；RTPCR试剂盒 (丹麦Fermentas公司)；PCR扩增仪(德国Eppendoff公司)；高速台式冷冻离心机(德国Eppendoff公司)；水平电泳仪(美国BioRad公司)；DBT08型凝胶成像分析仪(美国UVITEC公司).
　　1.2 方法
　　1.2.1 标本收集标本均在手术中收集. 食管癌组织均在原发灶取材，避开坏死、炎症区域；癌旁组织取自相应肿块旁2 cm的食管黏膜组织；远癌组织取自距肿块边缘5 cm以上的食管黏膜组织. 标本取材大小均约0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，取材后速冻于液氮中，后于-80℃超低温冰箱中贮存备用.
　　1.2.2 引物设计zac基因引物用Oligo 6.0软件设计，序列如下：上游5′CAT AGC CTC ACC CTC AGT CC3′；下游5′AGA GTG CTA TTC CCA AAG GT3′；扩增产物片段长度428 bp；做为内参照的GAPDH基因引物根据Fort等［6］报道的序列设计：上游5′CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG3′，下游 5′TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG3′，扩增产物片段长度443 bp，以上引物均由上海生工生物技术有限公司合成.
　　1.2.3 组织中总RNA的提取采用TRIzol试剂， 按常规步骤提取总RNA，RNA沉淀用50 μL DEPC水溶解. 琼脂糖凝胶电泳显示5 S，18 S和28 S的3条清晰条带，再经紫外分光光度仪测定260 nm和280 nm的A值，取A260 nm/A280 nm比值为1.8～2.0者用于反转录反应.
　　1.2.4 RTPCR扩增以提取的总RNA为模板，按试剂盒说明书进行操作. 反转录步骤如下：总RNA 8 μL，oligo(dT) 1 μL，无RNase水3 μL，混匀，离心. 70℃，5 min；立即置于冰浴，2 min. 加入5×Buffer 4 μL，RNase抑制剂1 μL，dNTP 2 μL，混匀， 37℃，5 min；加入反转录酶1 μL，42℃，60 min，70℃，10 min；立即置于冰浴，合成cDNA第一链. 以cDNA为模板进行PCR扩增. 我们选择扩增的是zac基因及GAPDH内参照基因，引物序列见1.2.2. PCR扩增反应步骤如下:反应体积为25 μL，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s；37个循环周期后，72℃，5 min，取出，4℃贮存备用. PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭染色)后，紫外透射反射仪下观察结果， 并在凝胶成像仪上照相，扫描所得灰度值进行统计学分析. 以100 bp DNAMarker为标准， 在428 bp位置出现条带为zac表达阳性， 而GAPDH在443 bp位置上出现条带为表达阳性.
　　统计学处理： zac mRNA的表达水平以x±s表示， 采用SPSS 13.0统计分析软包分析， 根据资料类型采用ANOVA， NewmanKeuls检验， χ2检验及Fishers Exact Test. P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳zac及内参GAPDH的RTPCR产物琼脂糖凝胶电泳，其大小与预先设计引物大小一致. 36例食管癌远癌组织中均有zac mRNA阳性表达；癌旁组织中有80.5%(29/36) zac mRNA阳性表达；食管癌组织中有38.8%(14/36) zac mRNA检测到阳性表达(图1A)；61.2% (22/36) zac mRNA表达缺失(图1B).

　2.2 zac mRNA在食管癌各组织中的表达情况
　　食管癌组织中zac mRNA阳性表达率为38.8%，而癌旁组织、远癌组织中分别为80.5%，100.0%，经统计学分析，食管癌组织中zac mRNA的阳性表达率低于癌旁组织（χ2=12.99，P&<0.05）和远癌组织(P=0.001)，而癌旁组织中zac mRNA的阳性表达率低于远癌组织（P=0.006）. 灰度扫描半定量分析，zac mRNA在食管癌组织、癌旁组织及远癌组织中阳性表达水平分别是0.38±0.13，0.72±0.16及0.80±0.12；经统计学分析，zac mRNA在食管癌组织的阳性表达水平低于在癌旁组织（q=5.64，P&<0.05）和在远癌组织（q=8.96， P&<0.05）中的表达， 且在癌旁组织中的表达也低于在远癌组织中的表达(q=4.41， P&<0.05).
　　2.3 zac mRNA表达与食管癌临床病理特征之间的关系
　　zac mRNA在食管癌组织中阳性表达率髓质型44.4%(4/9)，溃疡型38.1%(8/21)，缩窄型0%(0/1)，蕈伞型40.0%(2/5)；低分化20.8%(5/24)，中分化75.0%(6/8)，高分化75.0%(3/4)；Ｉ期50.0%(2/4)，Ⅱa期66.7%(8/12)，Ⅱb期0，Ⅲ期23.5%(4/17)，Ⅳ期0；有淋巴结转移组15.8%(3/19)，无淋巴结转移64.8%(11/17). 统计学分析表明：随着肿瘤细胞分化程度的升高，zac mRNA在食管癌组织中的阳性表达率也逐渐增加，低分化组分别与中、高分化组比较差异均有统计学意义（P=0.02），而中、高分化组之间比较差异无统计学（P=1.00）；zac mRNA在无淋巴结转移组癌组织中的阳性表达率高于有淋巴结转移组的阳性表达率(P=0.001)；食管癌组织中zac mRNA的阳性表达率与食管癌临床分期及病理类型差异均无统计学意义(P&>0.05).
　　3 讨论
　　zac与核受体辅助激活因子p300/LBP结合共同对细胞的分化、生长调控及内环境的稳定等起关键性的调节作用. May等［7］报道zac基因与p53基因有许多相似的功能， 其编码蛋白都能调节细胞周期、 细胞核受体及诱导凋亡， 两者均为特定序列的DNA结合蛋白并能作为其它转录激活蛋白的转录共同因子， zac蛋白可能作为一个与p53作用方式相似的转录因子.
　　我们的研究表明，食管癌组织中zac mRNA阳性表达率低于相应的癌旁组织和远癌组织(P&<0.05)，而后两者之间zac mRNA的阳性表达率也存在统计学差异(P&<0.05)；通过半定量分析表明，zac mRNA在食管癌组织中的表达水平低于癌旁组织及远癌粘膜组织，而且在癌旁组织中的表达水平低于远癌组织(P&<0.05). 随着肿瘤细胞分化程度的升高，zac mRNA在食管癌组织中的阳性表达率也逐渐增加(P&>0.05)；食管癌伴淋巴结转移组的zac mRNA阳性表达率低于无淋巴结转移组(P&<0.05)，提示食管癌中zac mRNA表达缺失或低表达预示肿瘤转移的可能性大，基因表达可能参与了抑制肿瘤细胞转移的调节. zac mRNA阳性表达率与食管癌临床分期和病理类型均无显著的统计学差异(P&>0.05). 本试验结果证实了食管癌组织中存在基因的低表达或表达缺失，可能是发展过程中的分子事件，有助于食管肿瘤的发生，参与了调控食管癌的发展过程.
　　在肿瘤组织中表达下调的基因一般被认为是潜在的抑癌基因，表达上调的基因可能对肿瘤发生、发展起促进作用. zac mRNA在食管癌组织中低表达和表达缺失进一步证实zac基因在食管癌中可能是候选的抑癌基因，发挥抑癌作用.

参考文献

　　［1］Varrault A， Ciani E， Apiou F， et al. hzac encodes a zinc finger protein with antiproliferative properties and maps to a chromosomal region frequently lost in cancer［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95(6):8835-8840.

　　［2］Bilanges B， Varrault A， Basyuk E， et al. Loss of expression of the candidate tumor suppressor gene zac in breast cancer cell lines and primary tumors［J］. Oncogene， 1999， 18(12):3979-3988.

　　［3］Cvetkovic D， Pisarcik D， Lee C， et al. Altered expression and loss of heterozygosity of the LOT1 gene in ovarian cancer［J］. Gynecol Oncol， 2004，95(9):449-455.

　　［4］Pagotto U， Thomas A， Theodoropoulou M， et al. The expression of the antiproliferative gene zac is lost or highly reduced in nonfunctioning pituitary adenomas［J］. Cancer Res， 2000， 60(23): 6794-6798.

　　［5］Koy S， Hauses M， Appelt H， et al. Loss of expression of zac/LOT1 in squamous cell carcinomas of head and neck［J］. Head Neck， 2004，26(4):338-344.

　　［6］Fort P， Marty L， Piechaczyk M. Various rat adult tissues express only one major mRNA species from the glyceraldehydes3phosphatedehydrogenate multigenic family［J］. Nucleic Acids Res， 1985， 13(5): 1431-1442.

　　［7］May P， May E. Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein［J］. Oncogene， 1999， 18(2):7621-7636.