苦参碱诱导A549细胞凋亡的机制分析

　　　　　　　　　　作者：范临夏　陶晓南　蔡曦光　刘华

【摘要】 目的：观察苦参碱抑制人肺腺癌细胞A549的增殖作用，并探讨其分子机制. 方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、电子显微镜、细胞周期分析法检测A549细胞凋亡；采用流式细胞术(FCM)测定细胞Bcl2， Bax及caspase3蛋白表达水平. 结果：苦参碱对A549细胞的增殖具有明显的抑制作用，并呈现剂量和时间依赖关系；电镜观察呈现典型的凋亡形态改变；细胞周期分析显示细胞增殖发生S/G2期阻滞；苦参碱能显著降低Bcl2蛋白表达(P&<0.01)；而显著升高Bax蛋白表达水平及caspase3活性. 结论：苦参碱可显著抑制A549细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调Bcl2表达水平改变线粒体膜通透性有关.
【关键词】 苦参碱；肺腺癌；凋亡；Bcl2；Bax；caspase3
　　【Abstract】 AIM: To study the inhibitory effect of matrine on the proliferation of A549 lung adenocarcinoma cells and its mechanism. METHODS: MTT assay，electron microscopy， and cell cycle analysis were used to examine the apoptosis in A549 cells. Expression levels of Bcl2， Bax and caspase3 proteins were measured with flow cytometry. RESULTS: Matrine exerted antiproliferative activity on A549 cells in a dose and timedependent manner. Typical apoptotic morphological changes of A549 lung adenocarcinoma cells were observed by electron microscope. Cell cycle analysis indicated that Sphase proportion was increased， as well as S/G2 phase was apparently arrested. Bcl2 protein expression was dramatically decreased (P&<0.01) whereas the expression of Bax and caspase3 was increased in A549 cells after treated by matrine. CONCLUSION: Matrine can exert the significant growthinhibitory effect on A549 cells and induce the cell apoptosis， which is probably related with the downregulation of Bcl2 expression via changing the permeability of mitochondrial membrane.
　　【Keywords】 matrine; lung adenocarcinoma; apoptosis; Bcl2; Bax; caspase3
　　0引言
　　苦参碱作为中药苦参的主要活性成分，临床主要用于镇痛、抑菌、抗病毒以及防治肝纤维化. 近年研究显示，苦参碱具有明显的抗肿瘤作用［1-2］. 雷怀定等［3］研究发现苦参碱对体外人肺癌A549细胞具有增殖抑制作用，我们观察苦参碱诱导人肺癌A549细胞凋亡及其机制，为苦参碱用于临床抗肿瘤提供理论依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　苦参碱购自宁夏盐池，配制为20 g/L的无菌溶液备用. MTT购自Sigma公司. 流式细胞术（flow cytometry， FCM）用mAb（FITCconjugated mouse antihuman Bax monoclonal antibody and IgG1 isotype control， FITCconjugated American Hamster antihuman Bcl2 monoclonal and American Hamster monoclonal IgG isotype control）为美国Caltag产品. A549细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所. 细胞贴壁生长于含100 mL/L小牛血清（杭州四季青生物工程公司）的RPMI 1640（Gibcol BRL公司）完全培养基中，用含2.5 g/L胰酶的消化液进行传代，置37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培养. 实验时选用对数生长期细胞.
　　1.2方法
　　1.2.1细胞增殖活性检测采用MTT比色法，将细胞密度调整为1×108/L，接种于96孔培养板（Costar），每孔100 μL，实验组分别加入不同浓度（30， 60， 120， 240 mg/L）苦参碱，对照组加入等体积PBS，另设培养液对照组，每组4个复孔，饱和湿度条件下，37℃， 50 mL/L CO2培养箱中培养，分别于24， 48， 72 h加入MTT 10 μL/孔. 继续培养4 h，每孔加入100 mL/L的SDS 100 μL终止培养，37℃过夜，用酶联免疫检测仪测定570 nm波长处A值，计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度（IC50）. 细胞经240 mg/L MATRINE作用48 h后用2.5 g/L胰酶消化，收集细胞悬液离心（900 r/min） 5 min，30 g/L冷戊二醛固定48 h，10 g/L四氧化锇染色，经梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，铀铅双染子显微镜（JEM1230，日本电子公司）观察细胞超微结构，美国Gatan公司CCD采集系统照相［4］.
　　1.2.2细胞周期分析MATRINE作用24，48 h后，收集A549细胞，PBS洗涤，700 mL/L冷乙醇固定，PI染色，FCM（Coulter EPICS XL）检测细胞周期时相的分布.
　　1.2.3流式细胞术分析A549细胞经苦参碱作用12， 24 h，收集1×106个细胞，PBS洗涤. 加入FITC标记的鼠抗人Bcl2 mAb， 鼠抗人Bax mAb及鼠IgG1同型对照后，FCM分别检测Bcl2， Bax及caspase3蛋白的阳性表达率和平均荧光强度［5］.
　　统计学处理: 数据以x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件包行方差分析. 显著性检验水平为a=0.01.
　　2结果
　　2.1苦参碱抑制A549细胞增殖作用A549细胞经苦参碱作用24， 48， 72 h后，代谢MTT的能力明显降低，显示较强的细胞毒性反应，且呈剂量效应、时间效应依赖关系（r24 h=0.745，r48 h=0.976，r72 h=0.963， P&<0.01，表1），24， 48， 72 h的IC50分别为108.20， 41.28和20.67 mg/L. ［根据A570值计算药物处理组细胞存活率(fu)将中效方程f a/fu=(D/ IC50)m两边取对数，得log (f a /fu)=log(D/ IC50)m=mlogD-mlog IC50. 设b=m， a=-mlog IC50， Y=log (f a/fu)， X=logD，则log IC50=-a/b 以药物浓度的对数为因变量，细胞抑制率与存活率之比的对数为应变量，作出一回归方程Y=bX+a. 利用该方程求出中效浓度IC50用回归方程求IC50］.表1苦参碱对A549细胞增殖的抑制作用(略)
　　2.2苦参碱诱导的A549细胞凋亡作用经相同浓度苦参碱分别处理A549细胞12， 24及48 h后， 电镜下观察到线粒体肿胀及内质网扩张等现象， 核内出现染色质凝集并边集、 核碎裂等凋亡的形态学改变（图1）.
　　2.3苦参碱对A549细胞周期分布的影响经60 mg/L， 120 mg/L的苦参碱作用，24 h后S期细胞所占比例为32.3%， 24.0%，48 h后为42.8%， 57.0%，与对照组（23.0%， 31.9%）比较均增加（P&<0.01），且随浓度增高而增多， 以120 mg/L苦参碱作用48 h时增加幅度较大，为同期生长的对照细胞的2倍，G2/M期细胞减少显著，提示细胞发生S/G2期阻滞(图2).
　　2.4苦参碱 对A549细胞Bcl2， Bax及Caspase3蛋白表达的影响Bcl2蛋白表达在不同浓度苦参碱处理组及不同时间均较对照组降低（P&<0.01，表2），有显著性差异（可重复实验双因素方差分析），高剂量苦参碱组降低Bcl2蛋白的作用大于低剂量苦参碱组， Bcl2蛋白下调以120 mg/L苦参碱作用24 h时最明显，为对照组的3.2倍. 苦参碱作用前后Bax的表达水平明显升高. Caspase3活性呈剂量依赖性升高.表2苦参碱对A549细胞蛋白表达的影响(略)

　　3讨论
　　探讨调控肿瘤细胞凋亡的分子机制是目前肿瘤学研究的重要课题，以药物诱导肿瘤细胞凋亡也被用于新的抗肿瘤药物的筛选. 苦参碱是一类研究和应用历史比较长的药物，但其抗肿瘤的作用还处于研究阶段. 我们通过苦参碱对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制实验发现：①苦参碱抑制细胞增长的作用具有周期性，可使细胞发生S期阻滞；②苦参碱可诱导细胞发生凋亡. 因此我们就其凋亡途径进行了进一步研究，结果表明，苦参碱下调Bcl2蛋白的表达水平.A，B分别为作用24，48 h后的对照组的细胞分布；C，D分别为60 mg/L， 120 mg/L苦参碱作用24 h后的细胞分布；E，F分别为60 mg/L， 120 mg/L苦参碱作用48 h后的细胞分布.
　　Bcl2家族的成员包括：Bcl2/Bax， Bclxl/Bclxs， Bak等，它们相互作用，参与细胞凋亡的调控，其中以Bcl2/Bax的作用尤为重要［6］. Bcl2蛋白是抗凋亡的因素，它能抑制许多因素引起的细胞凋亡. Bax过量表达则抑制Bcl2功能而促进细胞凋亡［7-8］. 体内Bcl2和Bax以二聚体形式发挥作用，若Bcl2同聚体形成则细胞存活，而当Bcl2与Bax形成异二聚体时则抑制Bcl2的抗凋亡功能，因此认为Bcl2与Bax之间的比值决定了细胞是否接受诱导凋亡的信号，决定着接受凋亡刺激后的生死. Bcl2家族诱导细胞凋亡的机制还有：① 作用于PTP相关蛋白，阻止PTP开放，维持ΔΨｍ；②抑制Ros诱导细胞凋亡. ③通过趋化Caspase至细胞内的膜结构上（可能就是线粒体膜）来阻断凋亡［9］. 药物所致的Bcl2蛋白的水平降低可引起线粒体内膜通透性的改变及随后的线粒体的释放反应（细胞色素C由线粒体膜间隙进入胞质）［10］，细胞色素C能与Apaf1和Caspase9形成一个复合体，在dATP，ATP存在下活化Caspase3，Caspase6及Caspase7等成员，使凋亡进行下去［11］. 在本实验中，Bcl2，Bax和Caspase3蛋白表达水平的规律性变化表明线粒体途径可能是苦参碱诱导A549细胞凋亡的机制之一.
基金项目：甘肃省科技攻关项目(2GS064A43020041)
【参考文献】
　　［1］刘伟，唐金花，王亚娣.苦参的研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17（5）:829-830.

　　［2］Metcalfe C，Thompson SG，Cowie MR，et al.The use of hospital admission data as a measure of outcome in clinical studies of heart failure［J］.Eur Heart J，2003，24:105-107.

　　［3］雷怀定，刘先军，涂明利，等.苦参碱对体外人肺腺癌A549细胞的抑制作用［J］.实用医学杂志，2006，22（5）:1717-1720.

　　［4］张慧芳，张煦，范临兰.鬼臼毒衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡［J］.第四军医大学学报，2006，27（16）:1516-1518.

　　［5］Baffa LC，Scarfi S，Mariani MR et al. Dihydrotestoterone as a selective cellular/nuclear location vector antigene peptide nucleic acid in prostatic carcinoma cells［J］.Cancer Res，2002，60(8):2258-2262.

　　［6］钟声，徐永健，张珍祥.CC10在苦参碱诱导的肺腺癌细胞凋亡中的表达［J］.华中科技大学学报:医学版，2006，35（1):124-127.

　　［7］Adams J，Cory S.The Bcl2 protein family:arbiters of cell survival［J］.Science，1998，281:1322-1323.

　　［8］Dinsdale D， Lee JC， Dewson G， et al. Intermediate filaments control the intracellular distribution of caspases during apoptosis［J］. Am J Pathol， 2004，164:395-407.

　　［9］Tian X， Zhang FM， Li WG. Antitumor and antioxidant activity of spin labeled derivatives of matrine (GP1) and congeners［J］. Life Sci， 2002，70(20):2433-2443.

　　［10］Chen J， Ramos J， Sirisawad M， et al. Motexafin gadolinium induces mitochondriallymediated caspasedependent apoptosis［J］.Apoptosis，2005，10(5):1131-1142.

　　［11］Ly JD， Grubb DR， Lawen A， et al. The mitochondrial membrane potential (ΔΨｍ) in apoptosis; an update［J］. Apoptosis，2003，8(2):115-128.