关于RNA体外干扰肝癌Hep 3B细胞VEGF基因的表达

　　　　　　　　　　 作者：蒋冬贵　夏昆　刘劫　罗红　潘乾　龙志高　夏家辉　　

【摘要】 目的： 通过自主构建的RNAi载体和体外合成siRNA的方法，寻找能有效干扰VEGF基因表达的载体和siRNA片段治疗肿瘤. 方法：将自主构建的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2，以及体外合成的TWvegf1和TWvegf2 siRNA片段转染肝癌Hep3B细胞，通过RTPCR，Western Blot和ELISA检测转染前后VEGF的mRNA及蛋白表达水平，以了解RNA干扰效果. 结果：两种RNA干扰的方法均能抑制VEGF基因的表达且差异具有显著性（mRNA，0.28，0.47，0.76，0.58 vs 1.2， P&<0.01;蛋白质，138， 121， 249， 227 vs 389 μg/L， P&<0.01）. 结论：两个质粒及siRNA片段均能有效的抑制VEGF基因的表达.
【关键词】 RNAi； siRNA； 血管内皮生长因子； 肝癌细胞
　　
　　【Abstract】 AIM: To construct RNAi plasmids and synthesize siRNA in vitro， transport them into Hep3B cells， so as to find some effective VEGF RNAi plasmids and siRNA segments. METHODS: The RNAi plasmids pcDUVEGF1， pcDUVEGF2 and siRNA segments TWvegf1， TWvegf2 were transported into Hep3B cells， and the expressions of VEGF mRNA and protein in the transfected Hep3B cells were checked using RTPCR， Western Blot and ELISA. The results were compared between the transfected and the normal Hep3B cells. RESULTS: There were prominent differences between the two groups in depressing the expression of mRNA (0.28， 0.47， 0.76， 0.58 vs 1.2， P&<0.01) and protein (138， 121， 249， 227 vs 389 μg/L， P&<0.01) of VEGF gene. CONCLUSION: The two RNAi plasmids and siRNA segments inhibit the expression of VEGF gene effectively.
　　【Keywords】 RNAi; siRNA; VEGF; hepatocarcinoma
　　0引言
　　VEGF/VEGFR系统在恶性肿瘤中的协同表达，旁/自分泌作用机制的确立为肿瘤的临床治疗提供了新的靶点. 在哺乳动物的细胞种发夹结构的双链RNA被剪切成siRNA，在体内组装成蛋白复合体，在siRNA的引导下Dicer酶切割靶RNA，或者以靶RNA为模板合成新的双链RNA，进一步被Dicer识别和剪切，21nt siRNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNAi作用［1-4］. 我们使用自主构建的RNAi真核基因表达载体pcDU6选择特异的VEGF基因片段构建VEGF基因的RNAi质粒，选择特异的VEGF基因片段体外合成21nt siRNA，并将它们脂转入肝癌Hep3B细胞后，通过RTPCR，Western Blot和ELISA的方法检测它们对VEGF mRNA和蛋白表达的抑制作用，以期找到可靠的抑制VEGF基因表达的质粒和siRNA片段，为肝癌的基因治疗提供一种新的方法.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　设计合成两段人U6 promoter315至+1的PCR寡核苷酸引物从人的gDNA中扩增出U6 promoter（5′端增加Bgl II，3′增加Apa I的酶切位点）.将PCR产物用Bgl II和Apa I双酶切后， 再将pcDNA3.1(-)质粒用Bgl II和Apa I双酶切，构建成RNAi质粒pcDU6，构建pcDU6的引物序列为 正向： 5′ gcagatctacgcgcaggcaaaacgcacc， 反向:5′ ttgggcccggtgtttcgtcctttccac. 根据高效RNAi基因片段的设计原则［2］，我们设计并从上海博亚生物制品有限公司申请合成了构建VEGF基因RNAi载体的寡核苷酸片段以及体外合成针对VEGF基因的siRNA的寡核苷酸片段，肝癌Hep3B细胞株购自CCTCC，非必需氨基酸（NAA）、丙酮酸钠、胎牛血清、胰酶、EDTA， G418均购自Gibcol公司，RPMI 1640干粉培养基购自Hyclone公司，脂质体2000 Invitrogen公司. T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System（Promega公司）；Klenow Fragment（Takara公司）；DEPC（Sigma公司）. Trizol Reagent(Gibcol BRL);174 Hinc digest DNA Marker，Taq酶宝生物工程有限公司；AMV逆转录试剂盒（Promega公司）；蛋白质Marker（上海生化试剂公司）；Xfilm（上海爱克发感光器材有限公司）VEGF ELISA检测试剂盒（Diognostics Systems公司）；兔抗人VEGF多抗（NEOMARKERS公司）；山羊抗兔二抗（PKD公司）.
　　1.2方法
　　实验组为pcDUVEGF1，pcDUVEGF2阳性克隆和转染Tvegf1，Tvegf2 siRNA的Hep3B细胞，对照组为常规培养的Hep3B细胞. 用Apa I 和BamH I双酶切pcDU6质粒，分别取RVEGF1，RVEGF2的Reverse，Forward，将酶切产物与双链的RVEGF1做连接，连接产物转化JM109，挑取阳性克隆并测序证实后扩增质粒. 将连接上RVEGF1的质粒取1 μL用BamH I和Hind III双酶切，将RVEGF2连接到带有RVEGF1的质粒上并测序证实，命名为pcDUVEGF1. 将RVEGF3和RVEGF4连接pcDU6质粒上并测序证实，命名为pcDUVEGF2. 将T7 promoter分别与TWvegf1，TWvegf2，TWvegf3，TWvegf4（均为1g/L）退火，用Klenow Fragment补平. 用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System试剂盒体外合成双链的RDNA，按TWvegf1与TWvegf2混合，TWvegf3与TWvegf4混合，分别往上述RDNA混合液中加入RnaseFreeDNase 1 μL于37℃温浴15 min后立即于95℃灭活酶活性5 min，常温下冷却，Qiagen小寡核苷酸纯化柱纯化. 所得产物分别命名为Tvegf1，Tvegf2，电泳跑2.0胶检测证实，-20℃保存待用. 按质粒、寡核苷酸（dNTP与siRNA的混合物）与脂质体的比例为1 μg∶2 μL混匀5 min，溶于不含血清的RPMI 1640液中，室温30 min后转染Hep3B细胞. siRNA转染Hep3B细胞24 h后换无血清培养24 h，取上清行Western Blot，ELISA检测，抽总RNA行RTPCR检测.

　　1.2.1VEGF mRNA表达的检测Hep3B细胞用有血清的RMPI1640培养基重悬. 当T25培养瓶细胞汇合率达到90%～95%时换液，PBS洗涤，各取20 μL脂质体和20 μg pEGFPN1（用以了解脂转效率），pcDUVEGF1 和pcDUVEGF2质粒混匀5 min后加无血清RPMI 1640培养基800 μL混匀后加入到上述T25瓶培养的Hep3B细胞上，50 mL/L CO2，37℃温箱培养24 h后加G418（800 mg/L）筛选. 将阳性克隆加有血清RMPI 1640培养基重悬并转移到6孔板中培养. 用Trizol抽实验组和对照组细胞的总RNA，同时用一对βactin引物做对照，做半定量RTPCR. 经电泳图像分析扫描得到VEGF与actin条带峰面积积分值比值作为计算VEGF PCR产物相对定量，比较实验组和对照组VEGF mRNA的表达丰度.
　　1.2.2VEGF蛋白的检测将实验组和对照组的变性上清跑100 g/L的PAGE胶，用Marker及阴阳性对照，行Western Blot检测. 另将实验组每种质粒、siRNA和对照组均设4孔50 mL/L CO2， 37℃培养24 h后，换无血清RMPI 1640培养基培养24 h，取上清冻存于-20℃. 用VEGF ELISA检测试剂盒的检测实验组和对照组的Hep3B细胞分泌的VEGF的量.
　　1.2.3Hep3B细胞生长曲线的测定将筛选出的RNAi阳性克隆细胞（包括空载体pcDU6）和转染siRNA（转染24 h后）接种于96孔培养板中，设空白对照（不含细胞的PBS）进行MTT法测细胞的活力. 测定570 nm处的吸光度A值，A值的大小反映Hep3B细胞成活数量及活性. 以时间为横坐标（d ），减去空白对照的吸光度A值为纵坐标绘制生长曲线图.
　　统计学处理:SPSS10.0软件进行t检验和F检验.
　　2结果
　　2．1RNAi质粒和siRNA对VEGF mRNA表达的影响构建好的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2质粒，体外合成的Tvegf1和Tvegf2 siRNA. βactin为内参照，按100 ng/mL培养基的Tvegf1，Tvegf2作用于Hep3B细胞后RTPCR扩增扫描Tvegf1组、VEGF2组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平明显降低， pcDUVEGF1组、pcDUVEGF2组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平明显降低. 而pcDUVEGF1组、pcDUVEGF2组、pcDU6组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平无明显差别，有血清对照组与无血清对照组比较VEGF mRNA表达水平无明显差别（图1）.
　　2.2VEGF蛋白质检测将实验组中pcDUVEGF1组、pcDUVEGF2组、Tvegf1组和Tvegf2组与对照组即无血清培养组及PRMPI 1640培养基行Western Blot检测，发现实验组的VEGF相对蛋白浓度（VEGF/actin）高于对照组（0.28，0.47，0.76，0.58 vs 1.2， P&<0.01）. 将实验组和对照组的Hep3B的上清进行ElISA检测发现，实验组各组的VEGF蛋白质浓度均明显低于对照组（138， 121， 249， 227 vs 389 μg/L， P&<0.01）， Tvegf1组与Tvegf2组比较无明显差异(P&>0.05)， pcDUVEGF2组明显低于pcDUVEGF1组（P&<0.01）.
　　2.3Hep3B细胞生长曲线TWvegf1和pcDUvegf2二组细胞生长均明显受到抑制（P&<0.01），TWvegf2和pcDUvegf1二组细胞生长均明显受到抑制(P&<0.05，图2).
　　3讨论
　　原发性肝癌(HCC)是典型的富血供恶性肿瘤. 肿瘤血管生成是HCC生长和转移的先决条件. 预先存在的血管发芽形成新血管包括释放血管新生因子、激活基质金属蛋白酶、降解细胞外基质及尔后的重塑细胞外基质等步骤［5］. 对HCC肿瘤血管生成分子机制的研究表明，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前已知在HCC 肿瘤血管生成中作用最强的血管生成诱导因子. 因此我们选择了VEGF基因作为RNAi肝癌基因治疗和肝癌与VEGF关系的研究的出发点. 按照选择高效的RNAi基因治疗的片段的原则，分别选择了2段针对VEGF基因的DNA片段用于构建VEGF基因的RNAi载体，2段针对VEGF基因的DNA片段用于体外合成siRNA片段，并分别将它们用脂质体转染Hep3B细胞，通过半定量RTPCR，Western Blot和ElISA检测VEGF基因的表达发现，这4个片段均能有效但（不完全）抑制VEGF基因的表达，且不同位置的RNA干扰效果存在明显的差别. 细胞抑制实验也得到了同样的结果. 这表明这些片段可以用于抑制肝癌细胞表达VEGF蛋白，从而抑制肝癌肿块的血管生长和肝癌细胞的增生和转移，达到基因治疗肝癌的目的.
　　实验结果表明我们设计的针对VEGF基因的RNAi载体和体外合成的siRNA能有效的抑制VEGF基因的表达，但是在实验的过程中我们发现，将载体和siRNA脂质体转染Hep3B细胞的效率低（约10%），且Hep3B细胞对裸鼠的致瘤率也低，这是阻碍将本实验方法用于动物实验的主要困难，如何改善转染效率是很重要的研究方面. 当VEGF基因被有效抑制后，肝癌细胞的生长和凋亡是否受到影响和受影响的程度是我们进一步的研究课题.