新的端粒酶有关蛋白T STAR在胃癌组织中的表达

　　　　　　　　　　 作者：金晓维，毛高平，周平，韩全利

【摘要】 　　目的：探讨新的端粒酶相关蛋白（TSTAR)与胃癌发生、发展的关系. 方法：用半定量RTPCR的方法检测32例人胃癌及相应癌旁组织中TSTAR mRNA的表达水平. 结果：TSTAR在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平分别为4.28±1.31，1.62±0.56（P&<0.01），低分化胃癌TSTAR的表达水平为4.75±1.13，显著高于中分化胃癌中的表达水平3.39±1.19（P&<0.05）. 结论：TSTAR在胃癌组织中高表达，且与病理分化程度相关，在胃癌的发生和发展中起重要作用.
【关键词】 胃肿瘤；逆转录聚合酶链反应；TSTAR
　　【Abstract】 AIM: To determine whether TSTAR is involved in the carcinogenesis and progression of gastric carcinoma. METHODS: The mRNA expression levels of TSTAR in tumor tissues and adjacent nontumor tissues in 32 cases of gastric carcinoma were systemically investigated using semiquantitative reverse transcriptionPCR. RESULTS: The mean mRNA expression levels of TSTAR was 4.28±1.31 in gastric cancer tissue specimens and 1.62±0.56 in the adjacent nontumor tissue specimens (P&<0.01). TSTAR was 4.75±1.13 in pooly differentiated histological type of gastric carcinoma， which was higher than that in moderate differentiated histological type ［(3.39±1.19)， P&<0.05］. CONCLUSION: The expression level of TSTAR in gastric cancer tissue is higher than that in adjacent nontumor tissue. The expression level of TSTAR is correlated with histological differentiation type of gastric carcinoma. These findings indicate that TSTAR might play an important role in the carcinogenesis and progression of gastric carcinoma.
　　【Keywords】 stomach neoplasm；RTPCR；TSTAR
　　引言
　　端粒酶与细胞永生化和肿瘤的发生关系密切［1］. 人类细胞端粒酶催化蛋白亚单位（hTERT）的转录调节是控制端粒酶活性的重要途径，端粒酶相关蛋白(testessignal transduction and activation of RNA，TSTAR)也可以通过正性或负性的方式调节端粒酶的活性. 有研究表明，新的端粒酶相关蛋白TSTAR对结肠癌细胞的端粒酶活性呈正相调节［2］. 我们采用半定量RTPCR的方法检测TSTAR在胃癌组织及癌旁组织中的表达，旨在进一步探讨TSTAR在胃癌发生发展中的可能作用.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 组织标本
　　收集空军总医院200405/200410经病理确诊、未经放化疗的手术或胃镜检查患者的胃癌组织标本32例按病理分型分为低分化癌组（低分化腺癌，印戒细胞癌等高度恶性的癌）21例；中分化癌组 （中分化腺癌）11例及癌旁胃黏膜组织(距癌组织边缘≥5 cm)(对照组)标本32例. 将新鲜切除的手术标本或活检的胃镜标本立即置于液氮中，后转至-70℃冰箱保存备用.
　　1.1.2 主要试剂
　　DEPC，Trizol，DNA Marker DMC50 （北京赛百盛公司）；Promega反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，MgCl2，琼脂糖，dNTPs（美国Promega公司）；氯仿，异丙醇，750 mL/L乙醇（ 北京化学试剂厂，由解放军第304医院烧伤研究所实验室提供）；TSTAR和三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase， GAPDH）引物（由上海生工合成）.
　　1.1.3 主要仪器
　　冷冻离心机Biofuge17RS西德；LG15W高速微量离心机 （北京医用离心机厂）；宏达1100电泳仪 （北京东方仪器厂）；DIAX900匀浆机 （美国）；Beckman DU7分光光度计 （美国）；Perkin Elmer PCR扩增仪 （美国）；超净工作台（苏州净化仪器厂）. （主要仪器均由解放军第304医院烧伤研究所实验室提供）.
　　1.2 方法
　　1.2.1 组织总RNA的提取
　将组织标本在液氮中碾碎后取100 mg置于冰中的匀浆器，加入1 mL Trizol匀浆，室温5 min，使核蛋白复合物充分溶解；加入0.2 mL氯仿，摇荡15 s，室温下孵育3 min，在4℃，12 000 g，离心15 min；转移水相至新的离心管，加入0.5 mL异丙醇，室温下孵育10 min，在4℃，12 000 g，离心10 min；将沉淀的RNA团块，用1 mL 750 mL/L乙醇洗涤2次，在4℃下，7500 g，离心5 min；将RNA团块在空气中干燥5～10 min后，溶解于DEPC处理过的双蒸水中，55℃～60℃温育10 min，使RNA完全溶解；用紫外分光光度仪测量RNA的浓度及A260 mn/A280 mn的比值；将提取的RNA置于8 g/L琼脂糖凝胶中电泳（200 V，30 min），检查18 S和28 S带的存在.
　　1.2.2 引物的设计
　　根据TSTAR及GAPDH的基因序列使用Primer Premier 5.0进行引物设计. 所设计的引物跨编码基因的内含子，以消除基因组DNA污染导致的假阳性结果. 对所设计的引物进行Blast分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），以排除可能的非特异产物的出现. 设计的TSTAR引物序列：上游5′ tcccgtaaaacagttccctaag 3′，下游5′ caggtggggcaaacacttcaat 3′，退火温度52℃，循环数为32次，长度226 bp；内参照GAPDH的引物序列：上游5′ ccacccatggcaaattccatggca 3′，下游5′ tctagacggcaggtcaggtccac 3′，退火温度54℃，循环数为32次，长度598 bp. 引物由上海生工合成.
　　1.2.3 cDNA的制备用Promega反转录试剂盒按说明将提取的RNA转录为cDNA.
　　1.2.4 PCR反应将转录所得的cDNA进行PCR反应， 反应体系为：5.0 μL 10×反应缓冲液，2.5 μL MgCl2，1.25 μL dNTPs，3.0 μL上游及下游引物，2.5 μL cDNA模板，32.25 μL去酶水，0.5 μL Taq酶，反应条件为：94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，60 s，共35个循环. 所得产物保存于-20℃，以备电泳分析.
　　1.2.5 琼脂糖电泳分析
　　将PCR产物在12 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100 V，电流约30 mA. 采用DMC50（共6条带：50，150，300，500，800，1000 bp）作为分子量标准，将产物同预计的大小进行比较，所得结果扫描入计算机.

　　统计学处理：用Bandscan 5.0对电泳结果进行灰度值分析，用t检验检测组间的差异. 首先比较胃癌及癌旁组织GAPDH表达的差异，然后检测胃癌组织相对于癌旁组织以及不同病理类型癌组织间TSTAR的表达变化，比较组间变化的差异. P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结果
　　2.1 GAPDH在胃癌和癌旁组织中的表达结果显示，GAPDH在胃癌组织中的平均表达水平为3.81±0.88，在癌旁组织中的表达水平为3.82±1.05. 两组间差异无统计学意义（P=0.913）.
　　2.2 TSTAR在胃癌和癌旁组织中的表达琼脂糖电泳分析结果显示， TSTAR在胃癌组织中的平均表达水平为4.28±1.31， 显著高于其在癌旁组织中的表达1.62±0.56 （P=0.000）. 图1所示为胃癌及癌旁组织TSTAR和GAPDH的RTPCR产物电泳的结果.
　　2.3 TSTAR的表达与胃癌病理分型的关系
　　低分化癌组的TSTAR mRNA平均表达水平为4.75±1.13，明显高于中分化癌组3.39±1.19，低分化癌组和中分化癌组两组间差异具有统计学意义（P=0.003）.说明TSTAR的表达水平与胃癌分化程度相关.
　　3 讨论
　　近年研究表明，端粒酶附加的蛋白质组分参与了端粒酶活性的调节［1］. 并可发生在多个水平，包括转录，mRNA的拼接，成熟，hTR和hTERT的修饰等，但其重要组分hTERT表达的转录调节是大多数细胞端粒酶活性激活的限速步骤［2］. 周平等［3］采用酵母双杂交技术，以hTERT作为靶蛋白，筛选端粒酶cDNA文库，获得了一种新的端粒酶相关蛋白TSTAR，并发现其能与hTERT相互作用，表明TSTAR对结肠癌细胞的端粒酶活性呈正相调节［2］. 我们采用半定量RTPCR的方法检测了胃癌组织及相应癌旁组织中TSTAR的表达情况. 发现TSTAR mRNA在胃癌组织中呈现高表达，TSTAR mRNA在低分化的胃癌组织中的表达明显高于其在中分化胃癌组织中的表达，这提示TSTAR可能与胃癌的发生和发展密切相关.
　　TSTAR是信号转导RNA激活蛋白(signal transduction and activation of RNA，STAR)家族的新成员，是一种磷酸酪氨酸蛋白和RNA结合蛋白，在细胞生长、增殖、转化中具有重要作用. hTERT 是决定端粒酶活性的核心，其磷酸化过程可调节端粒酶活性［4］. 研究表明，酪氨酸激酶cAB1能在体内、外不同条件下，通过自身SH3结构域与hTERT结合并使其磷酸化而抑制端粒酶活性［5］，TSTAR的同源物Sam68蛋白可以通过蛋白相互作用在体内、外均对Ab1SH3起促进作用［6-7］. 而TSTAR作为酪氨酸激酶信号传导通路的重要成分，可与其同源物Sam68蛋白结合成异源多聚体，而起到抑制Sam68蛋白与靶蛋白的作用. 为此，我们推测TSTAR可能是通过抑制Sam68蛋白，使其不能与Ab1SH3结合，从而导致Ab1SH3功能受抑制而增加端粒酶活性.
　　综上所述，TSTAR可能参与了酪氨酸蛋白激酶信号传递继而介入hTERT的可逆性磷酸化而上调了端粒酶的活性，进而促进肿瘤的发生和发展. TSTAR在胃癌中的高表达提示TSTAR可以作为胃癌新的标志物，也为我们提供了一个可能的靶分子用于胃癌的治疗. 有关TSTAR在胃癌发生和发展中的作用机制尚需进一步的研究.
【

参考文献

　　端粒酶与细胞永生化和肿瘤的发生关系密切［1］. 人类细胞端粒酶催化蛋白亚单位（hTERT）的转录调节是控制端粒酶活性的重要途径，端粒酶相关蛋白(testessignal transduction and activation of RNA，TSTAR)也可以通过正性或负性的方式调节端粒酶的活性. 有研究表明，新的端粒酶相关蛋白TSTAR对结肠癌细胞的端粒酶活性呈正相调节［2］. 我们采用半定量RTPCR的方法检测TSTAR在胃癌组织及癌旁组织中的表达，旨在进一步探讨TSTAR在胃癌发生发展中的可能作用.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织标本

　　收集空军总医院200405/200410经病理确诊、未经放化疗的手术或胃镜检查患者的胃癌组织标本32例按病理分型分为低分化癌组（低分化腺癌，印戒细胞癌等高度恶性的癌）21例；中分化癌组 （中分化腺癌）11例及癌旁胃黏膜组织(距癌组织边缘≥5 cm)(对照组)标本32例. 将新鲜切除的手术标本或活检的胃镜标本立即置于液氮中，后转至-70℃冰箱保存备用.

　　1.1.2 主要试剂

　　DEPC，Trizol，DNA Marker DMC50 （北京赛百盛公司）；Promega反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，MgCl2，琼脂糖，dNTPs（美国Promega公司）；氯仿，异丙醇，750 mL/L乙醇（ 北京化学试剂厂，由解放军第304医院烧伤研究所实验室提供）；TSTAR和三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase， GAPDH）引物（由上海生工合成）.

　　1.1.3 主要仪器

　　冷冻离心机Biofuge17RS西德；LG15W高速微量离心机 （北京医用离心机厂）；宏达1100电泳仪 （北京东方仪器厂）；DIAX900匀浆机 （美国）；Beckman DU7分光光度计 （美国）；Perkin Elmer PCR扩增仪 （美国）；超净工作台（苏州净化仪器厂）. （主要仪器均由解放军第304医院烧伤研究所实验室提供）.

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织总RNA的提取

　将组织标本在液氮中碾碎后取100 mg置于冰中的匀浆器，加入1 mL Trizol匀浆，室温5 min，使核蛋白复合物充分溶解；加入0.2 mL氯仿，摇荡15 s，室温下孵育3 min，在4℃，12 000 g，离心15 min；转移水相至新的离心管，加入0.5 mL异丙醇，室温下孵育10 min，在4℃，12 000 g，离心10 min；将沉淀的RNA团块，用1 mL 750 mL/L乙醇洗涤2次，在4℃下，7500 g，离心5 min；将RNA团块在空气中干燥5～10 min后，溶解于DEPC处理过的双蒸水中，55℃～60℃温育10 min，使RNA完全溶解；用紫外分光光度仪测量RNA的浓度及A260 mn/A280 mn的比值；将提取的RNA置于8 g/L琼脂糖凝胶中电泳（200 V，30 min），检查18 S和28 S带的存在.

　　1.2.2 引物的设计

　　根据TSTAR及GAPDH的基因序列使用Primer Premier 5.0进行引物设计. 所设计的引物跨编码基因的内含子，以消除基因组DNA污染导致的假阳性结果. 对所设计的引物进行Blast分析（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），以排除可能的非特异产物的出现. 设计的TSTAR引物序列：上游5′ tcccgtaaaacagttccctaag 3′，下游5′ caggtggggcaaacacttcaat 3′，退火温度52℃，循环数为32次，长度226 bp；内参照GAPDH的引物序列：上游5′ ccacccatggcaaattccatggca 3′，下游5′ tctagacggcaggtcaggtccac 3′，退火温度54℃，循环数为32次，长度598 bp. 引物由上海生工合成.

　　1.2.3 cDNA的制备用Promega反转录试剂盒按说明将提取的RNA转录为cDNA.

　　1.2.4 PCR反应将转录所得的cDNA进行PCR反应， 反应体系为：5.0 μL 10×反应缓冲液，2.5 μL MgCl2，1.25 μL dNTPs，3.0 μL上游及下游引物，2.5 μL cDNA模板，32.25 μL去酶水，0.5 μL Taq酶，反应条件为：94℃，30 s；52℃，30 s；72℃，60 s，共35个循环. 所得产物保存于-20℃，以备电泳分析.

　　1.2.5 琼脂糖电泳分析

　　将PCR产物在12 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100 V，电流约30 mA. 采用DMC50（共6条带：50，150，300，500，800，1000 bp）作为分子量标准，将产物同预计的大小进行比较，所得结果扫描入计算机.

　　统计学处理：用Bandscan 5.0对电泳结果进行灰度值分析，用t检验检测组间的差异. 首先比较胃癌及癌旁组织GAPDH表达的差异，然后检测胃癌组织相对于癌旁组织以及不同病理类型癌组织间TSTAR的表达变化，比较组间变化的差异. P&<0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 GAPDH在胃癌和癌旁组织中的表达结果显示，GAPDH在胃癌组织中的平均表达水平为3.81±0.88，在癌旁组织中的表达水平为3.82±1.05. 两组间差异无统计学意义（P=0.913）.

2.2 TSTAR在胃癌和癌旁组织中的表达琼脂糖电泳分析结果显示， TSTAR在胃癌组织中的平均表达水平为4.28±1.31， 显著高于其在癌旁组织中的表达1.62±0.56 （P=0.000）. 图1所示为胃癌及癌旁组织TSTAR和GAPDH的RTPCR产物电泳的结果.

　　2.3 TSTAR的表达与胃癌病理分型的关系

　　低分化癌组的TSTAR mRNA平均表达水平为4.75±1.13，明显高于中分化癌组3.39±1.19，低分化癌组和中分化癌组两组间差异具有统计学意义（P=0.003）.说明TSTAR的表达水平与胃癌分化程度相关.

　　3 讨论

　　近年研究表明，端粒酶附加的蛋白质组分参与了端粒酶活性的调节［1］. 并可发生在多个水平，包括转录，mRNA的拼接，成熟，hTR和hTERT的修饰等，但其重要组分hTERT表达的转录调节是大多数细胞端粒酶活性激活的限速步骤［2］. 周平等［3］采用酵母双杂交技术，以hTERT作为靶蛋白，筛选端粒酶cDNA文库，获得了一种新的端粒酶相关蛋白TSTAR，并发现其能与hTERT相互作用，表明TSTAR对结肠癌细胞的端粒酶活性呈正相调节［2］. 我们采用半定量RTPCR的方法检测了胃癌组织及相应癌旁组织中TSTAR的表达情况. 发现TSTAR mRNA在胃癌组织中呈现高表达，TSTAR mRNA在低分化的胃癌组织中的表达明显高于其在中分化胃癌组织中的表达，这提示TSTAR可能与胃癌的发生和发展密切相关.

　　TSTAR是信号转导RNA激活蛋白(signal transduction and activation of RNA，STAR)家族的新成员，是一种磷酸酪氨酸蛋白和RNA结合蛋白，在细胞生长、增殖、转化中具有重要作用. hTERT 是决定端粒酶活性的核心，其磷酸化过程可调节端粒酶活性［4］. 研究表明，酪氨酸激酶cAB1能在体内、外不同条件下，通过自身SH3结构域与hTERT结合并使其磷酸化而抑制端粒酶活性［5］，TSTAR的同源物Sam68蛋白可以通过蛋白相互作用在体内、外均对Ab1SH3起促进作用［6-7］. 而TSTAR作为酪氨酸激酶信号传导通路的重要成分，可与其同源物Sam68蛋白结合成异源多聚体，而起到抑制Sam68蛋白与靶蛋白的作用. 为此，我们推测TSTAR可能是通过抑制Sam68蛋白，使其不能与Ab1SH3结合，从而导致Ab1SH3功能受抑制而增加端粒酶活性.

　　综上所述，TSTAR可能参与了酪氨酸蛋白激酶信号传递继而介入hTERT的可逆性磷酸化而上调了端粒酶的活性，进而促进肿瘤的发生和发展. TSTAR在胃癌中的高表达提示TSTAR可以作为胃癌新的标志物，也为我们提供了一个可能的靶分子用于胃癌的治疗. 有关TSTAR在胃癌发生和发展中的作用机制尚需进一步的研究.