关于Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定

【摘要】 目的：构建Cdh1小干扰RNA载体，并将其转染至Hela细胞进行鉴定. 方法：根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求，设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体，形成完整载体，进行测序鉴定. 分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞，转染后48 h提取细胞总RNA及细胞总蛋白，采用实时定量PCR和Western Blot检测Cdh1的表达. 结果：经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体，分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol. 与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低（P&<0.05）. 结论：成功构建Cdh1小干扰RNA载体，并能下调Hela细胞Cdh1的表达.
【关键词】 细胞周期 细胞分裂 RNA 小干扰 Hela细胞
　　0引言
　　Cdh1是细胞周期后期分裂促进复合物（anaphasepromoting complex，APC）的一个调节亚基，在细胞周期调控中发挥着重要作用. 近年来研究发现，Cdh1APC在哺乳动物神经元中有大量表达，具有调节轴突生长和突触形成的功能，其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用［1］. 为了进一步探讨Cdh1的功能，我们拟构建Cdh1小干扰RNA载体，并将其转染至Hela细胞进行鉴定.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　pENTRTM/H1/TO载体试剂盒、TOP10感受态细菌和脂质体Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司（美国）； DMEM/F12培养基、小牛血清购自Gibco公司（美国）；实时定量PCR试剂盒购自Takara公司（日本）；LightCycler实时荧光定量PCR仪为Roche 公司（美国）.
　　1.2方法
　　1.2.1载体的构建
　　根据pENTRTM/H1/TO载体要求和

参考文献

［2］设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，具体设计如下: 干扰序列top strand 5′CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGA
GACTTCTCA3′， bottom strand 5′AAAATGAGAAGT
CTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT3′; 对照序列top strand 5′CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3′，　　bottom strand 5′AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3′.
将干扰序列和对照序列根据退火条件95℃退火4 min，室温自然冷却5～10 min得到退火产物， 用T4 DNA连接酶连接到pENTRTM/H1/TO线性载体上，16℃连接2 h，连接产物转化TOP10感受态细菌，平铺入含卡那霉素（50 mg/L）抗性平板中过夜培养，挑取单菌落扩增培养. 提取质粒后，由英骏生物技术有限公司进行DNA测序鉴定. 质粒分别命名为pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol.
　　1.2.2细胞转染采用脂质体转染法
　　将pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol质粒分别转染Hela细胞，转染前1 d将Hela细胞传代至六孔板，密度为90％左右，在2个Eppendorf管中均加入250 μL OPTIMEMⅠ培养基，然后分别加入10 μL脂质体和4 μg质粒混匀，室温下孵育5 min. 轻柔混合两管液体，37℃孵育20 min，加入Hela细胞中，将细胞置于37℃， 50 mL/L CO2培养箱中转染4 h后换成含有100 mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基. 转染后48 h，提取细胞总mRNA，逆转录成cDNA.
　　1.2.3实时定量PCR检测Cdh1的表达
　　以逆转录产物为模板进行实时定量PCR反应，以βactin基因为内参照， 94℃变性5 s，60℃退火及延伸20 s，共反应40个循环，分析融解曲线. Cdh1基因上游引物为5′GCCAACTGGAGCGTGAACTT3′，下游引物为5′TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3′. βactin基因上游引物为5′TGACAGGATGCAGAAGGAGA3′，下游引物为5′TAGAGCCACCAATCCACACA3′. 以△Ct表示Cdh1的表达，△Ct=Ct （Cdh1）- Ct（βactin ），△Ct值越高，Cdh1的表达越低［3］.
　　1.2.4Western Blot检测Cdh1的表达
　　分别提取转pENTR/shcdh1， pENTR/shcontrol及未转染的Hela细胞总蛋白，以βactin为内参照，取等量的蛋白质经聚丙稀酰胺凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜上， 用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加10 mg/L抗Cdh1 mAb或抗βactin mAb，室温孵育1 h，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，漂洗后二氨基联苯胺显色2～3 min，水洗后照相.
　　统计学处理: 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以x±s表示，采用方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1载体的构建
　　经测序公司鉴定后构建的质粒pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol，序列完全正确，无碱基突变.
　　2.2实时定量PCR检测
　　Hela细胞Cdh1的表达融解曲线分析表明设计的引物均得到了特异性的产物，与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达明显降低（P&<0.05， 表1）.表1实时定量PCR检测Hela细胞中Cdh1的表达（略） 转贴于 　2.3Western Blot检测
　　Cdh1蛋白的表达与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1蛋白表达水平明显降低(图1).
　　3讨论
　　细胞周期分裂后期促进复合物及其调节亚基Cdh1不仅在增殖细胞中起重要作用，研究发现其在哺乳动物大脑皮质、海马、小脑等部位的终分化神经元核内有大量的表达，且具有泛素化周期蛋白B的活性，泛素化其他的底物，发挥其潜在作用［4］. 研究表明在不同类型的神经元，Cdh1APC的表达降低引起的结果可能也不一样. 在胚胎鼠皮质神经元，降低Cdh1APC的表达，周期蛋白B表达升高，使细胞异常地重新进入细胞周期，引起神经元的凋亡［5］； 而在新生鼠小脑颗粒神经元，抑制Cdh1APC的表达及活性，发现神经元仍可存活，且轴突增长［1］.
　　RNA干扰技术是指生物体内导入短的双链RNA(dsRNA)后使体内同源基因特异性的沉默. siRNA的来源有多种，如化学合成、体外转录合成及利用质粒或病毒载体表达siRNA. 2002年，Brummelkamp等［6］首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达. 在体内表达的shRNA与dsRNA很接近，它包含了两个由一个小环序列分离的短反向重复序列，是由PolⅢ启动子控制的. 此方法可以长期抑制目的基因表达，因此，本课题选择载体构建的方法来实现基因下调.
实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，该技术已被广泛应用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异等. 本研究我们通过脂质体法将构建成功的载体转染至Hela细胞中，结果显示转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达明显降低，说明该载体具有基因下调作用.

【参考文献】
　　［1］Konishi Y， Stegmuller J， Matsuda T， et al. Cdh1APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain ［J］. Science， 2004， 303（5660）:1026-1030.

　　［2］Bashir T， Dorrello NV， Amador V， et al. Control of the SCF (Skp2Cks1) ubiquitin ligase by the APC/C(Cdh1) ubiquitin ligase［J］. Nature， 2004， 428（6979）:190-193.

　　［3］Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(Delta Delta C(T)) method［J］. Methods， 2001，25(4):402-408.

　　［4］Gieffers C， Peters BH， Kramer ER， et al. Expression of the CDH1associated form of the anaphasepromoting complex in postmitotic neurons ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1999， 96（20）: 11317-11322.

　　［5］Almeida A， Bolanos J.P，Moreno S， et al. Cdh1/Hct1APC is essential for the survival of postmitotic neurons ［J］. Neuroscience， 2005，25（36）:8115-8121.

　　［6］Brummelkamp TR， Bernards R， Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］. Science， 2002，296（5567）:550-553.