关于激光扫描共聚焦显微镜观察贲门肿瘤细胞药物诱导后Ca2+浓度变化的意义

作者：张向阳 门金娥 郑海萍 田珂 刘建霞

【关键词】 激光扫描共聚焦;显微镜；肿瘤；消化道
　　【关键词】 激光扫描共聚焦;显微镜；肿瘤；消化道
　　0引言
　　激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器［1］. 使用钙高度特异性荧光指示剂Flou3/Am能观察到细胞内Ca2+浓度变化. 大量实验证明，在多种刺激因子作用不同细胞诱导凋亡或病理条件下细胞自发凋亡的过程中，都普遍存在胞质钙的持续升高［2］. 我们通过LSCM检测化疗药物引起贲门肿瘤细胞Ca2+浓度的变化，并同用MTT法测得的药敏结果比较，以探讨Ca2+浓度变化与药敏的关系.
　　1材料和方法
　　1.1材料标本均来源于河北工程学院附属医院手术切除的贲门肿瘤组织；MTT(Sigma公司)；RPMI1640(Gibco公司)；Flou3/Am(Biotium公司)；顺铂(山东省德州制药厂)；甲氨蝶呤(北京医科大学实验药厂)；阿霉素(明治医药有限公司)；丝裂霉素(上海新亚药业有限公司)；5氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司)；LSCM MRC1024(BioRad)；二氧化碳培养箱（Sanyo公司）.
　　1.2方法将肿瘤组织置入含RPMI1640培养液的无菌器皿中，机械方法制成细胞悬液，调整细胞密度为（1～3）×108/L. 将细胞悬液接种于96孔培养板（90 μL/L），置50 mL/L CO2， 37℃二氧化碳孵箱内培养4 h，分2组分别加入顺铂、甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素和5氟尿嘧啶5种化疗药物（10 μL/孔），并设空白孔和对照孔. 继续培养12 h后取一组96孔板，收集细胞液，加入50 μL Fluo3/AM (10 μmol/L)， 继续孵育1 h，洗去多余的Fluo3/AM，用LSCM检测细胞内Ca2+浓度变化. 细胞培养72 h后，取一组96孔板，弃去上清，每孔加入2 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，每孔加入二甲基亚砜150 μL，室温振荡10 min，用酶标仪（λ=550 nm）测定每孔吸光度（A）值. 相对抑制率（%）=（对照组A-加药组A）/对照组A×100%，相对抑制率≥30%为敏感，相对抑制率＜30%为不敏感. 数据采用PEMS3.1软件进行Wilcoxon秩和检验.
　　2结果
　　化疗药物引起的贲门肿瘤细胞内Ca2+浓度变化与药敏关系见表1. 敏感药物与不敏感药物引起的贲门肿瘤细胞Ca2+浓度变化之间具有显著差别（P&<0.05），敏感药物引起的贲门肿瘤细胞内Ca2+的浓度变化明显大于不敏感药物. 转贴于 　　表1贲门肿瘤细胞内Ca2+浓度的变化与MTT药敏结果比较（略）
　　3讨论
　　研究证明，目前使用的许多抗癌药均可在不同类型的敏感肿瘤细胞中诱导凋亡. 药物的抗肿瘤效果不仅取决于药物对靶细胞的直接作用，更在于其诱导敏感肿瘤细胞凋亡的能力. 化疗诱导细胞凋亡的机制分三个阶段， 在最后一个阶段，化疗药物仅能使对其敏感的细胞而非耐受细胞产生凋亡的bax基因表达，最后导致凋亡发生，选择敏感药物诱导细胞凋亡成为化疗的目的. Ca2+作为参与许多生命活动的关键第二信使，在细胞凋亡中的作用受到普遍关注［3］. Ca2+本身就是一种诱导细胞凋亡的信号，已得到多方面的证实.
　　临床抗癌药物筛选常用MTT比色法，但MTT比色法需3 d时间，在药敏结果出来之前，患者的用药在很大程度上尚靠经验去选定化疗药物. 发生凋亡的细胞最早可以测及的生物变化是细胞内快速持续的Ca2+浓度的升高，我们使用化疗药物作用贲门肿瘤细胞后，将LSCM检测的Ca2+浓度变化与MTT法测得的药敏结果相比较，结果显示与不敏感药物相比，敏感药物能引起贲门肿瘤细胞Ca2+浓度的更大变化，通过LSCM检测化疗药物诱导后贲门肿瘤细胞Ca2+浓度变化，可以在MTT药敏结果出来之前为临床用药提供参考.
　　【参考文献】
　　［1］ 王春梅，黄晓峰，李玉松，等. 激光共聚焦显微镜与荧光显微镜在医学研究中的比较［J］. 第四军医大学学报， 1997， 12: 62-63.
　　［2］ Nicotera P，Orrenius S. The role of calcium in apoptosis［J］. Cell Calcium， 1998，23(23):173-180.
　　［3］ Rizzuto R， Pinton P， Ferrari D， et al. Calcium and apoptosis:facts and hypotheses［J］. Oncogene， 2003，22(53):8619-8627.