作者：王俊涛 田铧 肖思建 尉春晓 刘奔 李盛梅
【关键词】 白芨；脑缺血疾病；模型，动物；大鼠
【Abstract】 AIM: To develop a new embolic model of cerebral ischemia induced by common bletilla tuber in Wister rats. METHODS: The suspension of bletilla particles or bletilla gum was injected into the right internal carotid artery after the external carotid artery was exposed in Wister rats. In a certain period after operation， the assessment of neurological defects， red tetrazoline (TTC) staining and HE staining were performed. RESULTS: Four hours after operation， rats injected with bletilla particles developed temporary conscious disturbance， and sustained hemiparesis of contralateral limbs with spontaneous circling behavior. Ischemia or infarction was found obviously in the cortex of parietal， frontal lobes and basal nuclei of the right cerebral hemisphere， where the neurons characterized with vague outlines， pyknosis and necrosis of neuron nuclei were recognized as well. But hemiparesis and spontaneous circling behavior only lasted for 12 h after embolization with bletilla gum. CONCLUSION: Bletilla particles can be used to develop a sustained cerebral ischemia model in rats.
【Keywords】 common bletilla tuber；cerebral ischemia model；rats
【摘要】 目的：以中药白芨作为栓塞剂建立大鼠脑缺血模型，探讨这一新方法的可行性. 方法：手术暴露大鼠右侧颈部血管，向右颈内动脉注入一定量的白芨微粒悬液或白芨胶，在术后一定时间内进行神经功能缺失评分、大脑切片红四氮唑（TTC）染色和组织学H.E染色. 结果：白芨微粒组大鼠术后4 h内呈现意识障碍，持续性对侧肢体轻度偏瘫及环转，TTC染色显示右侧大脑半球额叶、顶叶皮层和基底核附近局灶性缺血或梗塞，光学显微镜下可见缺血区脑组织水肿或坏死，神经元轮廓模糊，核固缩或裂解等；白芨胶组仅在术后术后1 h内有轻度意识障碍，12 h内出现对侧肢体行动障碍，但未见明显病理改变. 结论：白芨微粒可以作为栓塞剂建立大鼠脑缺血模型.
【关键词】 白芨；脑缺血疾病；模型，动物；大鼠
0引言
脑缺血模型是研究缺血性脑部疾病的重要手段. 目前常见的制备脑缺血模型的方法有线栓法、血凝块法、电凝法等多种方法，各种方法优势各异［1］. 中药白芨因富含白芨胶在近些年来常用作栓塞剂进行器官栓塞或肿瘤治疗方面的研究［2-3］，但将白芨作为栓塞剂用于大鼠脑缺血模型的报道甚少. 本文用白芨微粒和白芨胶作栓塞剂建立大鼠脑缺血模型，对其可行性进行探讨.
1材料和方法
1.1材料Wistar大鼠12 只（山东大学实验动物中心提供），体质量240~270 g，雌雄不限，随机分成二组：白芨微粒栓塞组6只，白芨胶栓塞组4只，余2只为对照. 参照文献［3］制作白芨微粒，筛选160目（直径97 μm）微粒，置干净小瓶内封存，高温高压消毒，术前加生理盐水制成5 g/L的悬液；白芨胶由济南千佛山医院药剂室协助制备，制备方法参照文献［4］，加生理盐水配成8 g/L的溶液.
1.2方法术前大鼠禁食12 h，禁水3~4 h. 用100 mL/L水合氯醛按3 μL/g行腹腔注射麻醉，麻醉前15 min股部肌肉注射阿托品（0.05 mg/kg）. 沿颈正中稍偏右作纵行切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及其分支. 动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉的分支翼腭突动脉暂时止血，由颈外动脉缓慢注入白芨栓塞剂：白芨微粒组注入5 g/L白芨微粒悬液0.1 mL，注射速度控制在0.01 mL/s左右；白芨胶组注入8 g/L白芨胶0.2 mL. 注入完毕后结扎颈外动脉、颈总动脉，放开动脉夹. 对照组大鼠行模拟手术，分离并结扎颈外动脉和颈总动脉，但不进行栓塞. 术后肌肉注射青霉素4万U，2次/d，给药3 d.
1.3神经功能障碍检查评分术后依照Longa评分法对大鼠神经行为障碍程度进行观察评分［5］.
1.4TTC显色和病理学观察于术后1， 5 d急性处死大鼠并取脑. 从距大脑额端5 mm处开始冠状切2 mm厚的脑片共4片，放入20 g/L红四氮唑（TTC）溶液中，置保温箱中避光37℃反应30 min，正常组织细胞显红色，梗死组织不显色或呈苍白色. 取出后放入含40 g/L甲醛的PBS溶液中固定，拍片. 然后取双侧大脑外侧沟附近的脑片做石蜡包埋和HE染色，光学显微镜下观察脑组织病理变化.
2结果
2.1神经行为学障碍评分手术大鼠全部成活. 白芨微粒组大鼠术后3~4 h存在明显意识障碍（处于半昏迷状态，对刺激有反应），容易向左侧倾倒，4 h左右清醒，出现左侧肢体运动障碍、自发向左侧转圈等症状，提尾巴提起可见左前肢向内屈曲，症状恒定持续至5 d处死. 全部大鼠术后4 h~5 d评分均大于1 分，示栓塞结果有效. 白芨胶组大鼠在术后1 h内有轻度意识障碍，1 h左右清醒，表现为左侧肢体运动障碍，向左侧转圈或倾倒等症状，即评分有效，但术后8~12 h症状逐渐消失. 对照组大鼠术后20 min左右清醒，无异常表现（表1）.
表1大鼠神经行为学障碍评分结果（略）
评分&>1示栓塞结果有效.
2.2TTC显色结果术后1，5 d开颅取脑，发现白芨微粒组大鼠右侧大脑半球额叶、顶叶呈现形状不规则的苍白区. 脑冠状切片TTC染色发现右侧大脑半球有苍白色的梗塞区，梗塞部位主要发生于顶叶及额叶皮质层和基底核附近（图1）. 白芨胶组术后TTC染色未见明显改变.
2.3病理学变化光学显微镜下，白芨微粒组大鼠术后1 d可见脑组织局灶性水肿，神经元轮廓模糊，细胞收缩，细胞周围出现间隙等病变；术后5 d缺血区脑组织梗塞、出现许多空隙，神经元损伤或坏死，细胞核固缩深染，轴突消失或胞浆崩解（图2）. 病变主要见于梗塞部位，主要发生于顶叶及额叶的脑皮质和基底核附近. 白芨胶组大鼠术后1 d栓塞侧脑皮质有轻度的局灶性组织水肿，术后5 d未见明显病理改变. 白芨微粒组和白芨胶组非栓塞侧脑组织以及对照组脑组织均未见病理改变.
图1白芨微粒组大鼠术后5 d大脑冠状切面TTC染色，正常脑组织显示红色，右侧大脑半球皮质未显色区为脑梗塞区（N）（略）
A: 栓塞侧大脑半球皮质呈局灶性缺血，神经组织水肿或呈空泡样变，神经元轮廓模糊，核固缩，轴突消失或细胞裂解； B: 对侧大脑半球皮质神经元轮廓清晰，可见明显的突起.
图2白芨微粒组大鼠术后5 d的大脑半球皮质HE ×400（略）
Wister大鼠脑血供存在丰富的侧支循环，单纯结扎双侧颈总动脉亦不足以使脑缺血，因此，目前一般根据研究需要选择不同的栓塞方法结合颈总动脉或颈内动脉结扎制作动物脑缺血模型［1］.
中药白芨富含粘胶类物质白芨胶，白芨胶是由甘露糖和葡萄糖聚合而成的高分子化合物，无毒性、无抗原性［4，6］，具有促进红细胞积聚，缩短凝血时间及凝血酶原时间的作用，所以能促进血栓形成［7］. 研究资料表明白芨胶或白芨微粒是理想的血管栓塞剂［2-3，6］. 近些年来，研究者利用白芨微粒持久的栓塞作用和促凝血、抗炎等作用，将其与化疗药混合进行肿瘤栓塞化疗方面的研究，取得了比采用碘油、明胶海绵等常规栓塞剂效果更为可靠和持久治疗效果［2-3］. 迄今为止，将白芨用于建立脑缺血模型的报道甚少，仅有用白芨胶建立兔脑缺血模型的报道［8］.
我们尝试用白芨胶和白芨微粒制作大鼠脑缺血模型. 结果发现白芨胶导致短暂的神经缺失症状，如对侧肢体肌力减退，身体向对侧倾倒等，症状与文献［8］报道的用白芨胶制作兔脑缺血模型的症状相似. 但不同的是本研究脑栓塞症状持续时间较短，仅维持8-12 h即恢复正常. 病理切片显示的栓塞侧脑组织仅术后1 d有轻度局灶性组织水肿，术后5 d则未见明显病理改变，提示所用剂量的白芨胶尚不足以引起大鼠持久的脑缺血. 白芨胶是水溶性胶体［4，6］，容易逐渐混入血流而难以在大脑中动脉及其分支内滞留较长时间.
本实验我们用白芨微粒作栓塞剂制作大鼠脑缺血模型，结果引起明显的意识障碍、神经行为学异常和相应的局灶性脑梗塞病理改变，各项变化与血凝块法、线拴法等其他栓塞法制备脑缺血模型的典型改变相符［9-10］，而且症状一直维持到处死前第5 d，说明效果持久，方法可行. 白芨微粒组大鼠术后呈现半昏迷状态，苏醒时间较白芨胶组明显延长，与栓塞后的脑组织病理改变与否相吻合，该项结果支持将动物术后苏醒时间长短作为判断脑梗塞指标的观点［9］. 尽管血凝块法被公认为是最贴近脑血管病的理想栓塞剂，但动物实验表明血凝块容易自溶，影响结果的恒定性［10］. 白芨微粒能到达远端微小动脉，内含粘胶成分能促进血栓形成［4，6］，所含的纤维不易溶解，从而发挥持久的栓塞作用. 由此我们认为白芨微粒作栓塞剂可能比较适合于需要制作长期脑缺血模型的研究.
参考文献
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