作者：杨俊霞 石华 魏丽丽 袁成福 陈济 易发平 马永平 宋方洲
【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达
【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of human melaninconcentrating hormone receptor 2 (MCHR2) and stably transfect HEK293 cells with it. METHODS: The fulllength MCHR2 cDNA fragment was amplified by PCR from the human fetal brain cDNA library and was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+). After identification of restriction digestion and PCR， the recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by lipofectamine. After screening culture by G418， a stablytransfected cell line was established， and the transcription and expression of the MCHR2 gene were identified by RTPCR， Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The eukaryotic expression vector pcDNA3.1MCHR2 was successfully constructed and the MCHR2 gene was transfected stably into HEK293 cells. A stablytransfected cell line was established and the MCHR2 gene was expressed successfully. CONCLUSION: The establishment of the stablytransfected cell line and the expression of the target gene provide a solid experimental foundation for further studies on the function of the MCHR2 gene.
【Keywords】 MCHR2；eukaryotic expression vector； transfection；gene expression
【摘要】 目的：构建人MCHR2真核表达载体，转染HEK293细胞，建立稳定转染细胞系. 方法：采用PCR方法，以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)，经酶切和PCR鉴定后，脂质体转染法转染HEK293细胞，通过G418选择培养，建立稳定转染细胞系，RTPCR，Western Blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达. 结果：成功构建了pcDNA3.1MCHR2真核表达载体并已稳定转入HEK293细胞，建立了稳定转染细胞系，成功地表达目的基因. 结论：稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究MCHR2的功能提供了良好的实验基础.
【关键词】 MCHR2；真核表达载体；转染；基因表达
0引言
近年来研究发现肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切相关［1］，继神经肽Y、刺鼠相关蛋白、增食欲素之后，又一个增强食欲的神经肽黑色素浓集激素(melaninconcentrating hormone， MCH)进入人们的视野. 现已发现其有2种受体亚型，即MCHR1和MCHR2均属于G蛋白偶联受体家族. 通过构建转基因和基因敲除动物模型已对MCH及MCHR1与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究，但有关MCHR2的功能至今仍不十分清楚. 为此我们构建了人MCHR2基因的真核表达载体，并转染HEK293细胞，建立了稳定表达MCHR2的细胞系，为深入研究MCHR2的生物学功能奠定实验基础.
1材料和方法
1.1材料人胎脑cDNA文库购自Clontech公司. 菌株E. coli DH5α，质粒pcDNA3.1(+)和HEK293细胞由本教研室保存. RTPCR试剂盒(TOYOBO公司)；Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，限制性内切酶(EcoR I，Xho I)等工具酶(TaKaRa公司)；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(Qiagen公司)；脂质体LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)；G418 (Amresco公司)；总RNA抽提液TriPure (Roche公司)；MCHR2抗体(Santa Cruz公司);HRP标记的兔抗羊IgG和FITC标记的兔抗羊IgG(北京鼎国生物技术有限公司).
1.2方法
1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人MCHR2基因的序列（序列号为：AY562946）设计引物. 上游引物为：5′ccggaattcACCATGAATCCATTTCATGCATCTTG3′；下游引物为：5′ccgctcgagATGGTGATCCATGTACTTTCCTAA3′. 其中分别在上游和下游引物的5′端加上了EcoR I和Xho I的酶切位点和3个保护碱基，并且在起始密码前添加了Kozak序列，引物由TaKaRa公司合成.
1.2.2人MCHR2全长cDNA的获取以人胎脑cDNA文库为模板，采用PCR的方式扩增人MCHR2 cDNA的编码区，全长为1023 bp. PCR 50 μL 反应体系中加入cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL，20 μmol/L上下游引物各1 μL，，Taq酶0.5 μL ，加水至50 μL. 反应条件：94℃ 5 min；94℃ 60 s，57℃ 50 s，72℃ 70 s，35个循环；72℃ 7 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定.
1.2.3人MCHR2真核表达载体的构建将上述PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4 DNA连接酶连接后转化E. coli DH5α感受态，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，阳性克隆的质粒DNA经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1MCHR2.
1.2.4建立稳定转染人MCHR2的HEK293细胞系HEK293细胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，50 mL/L CO2的饱和湿度下培养. 待细胞融合至70%~80％时按照LipofeetamineTM 2000操作说明书进行空质粒pcDNA3.1(+)和重组质粒pcDNA3.1MCHR2的转染. 转染48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，在含有G418 (700 mg/L)的选择性培养基中加压筛选约4~6 wk，获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆，有限稀释法扩增培养即为稳定表达人MCHR2的HEK293细胞系，命名为HEK293MCHR2细胞.
1.2.5RTPCR检测MCHR2转录水平的表达收集HEK293空质粒转染细胞以及HEK293MCHR2转染细胞，按TriPure试剂说明书抽提细胞总RNA. 反转录20 μL体系中加入总RNA 2 μL，随机引物1 μL，5×RT Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNAase抑制剂1 μL，MMLV逆转录酶1 μL，加水补足至20 μL，混匀，30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min终止反应. 以GAPDH（450 bp）为内参进行PCR反应. 在25 μL反应体系中加入cDNA模板5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.25 μL，加水补足至25 μL，反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 60 s，57℃ 50 s，72℃ 60 s，30个循环；72℃ 10 min. 取等体积RTPCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析.
1.2.6Western Blot检测MCHR2翻译水平的表达收集转染细胞，裂解后取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳 (50 g/L浓缩胶，恒压80 V，30 min；100 g/L分离胶，恒压100 V，2.5 h)，电转移至PVDF膜上(恒流80 mA，3 h)，50 g/L脱脂奶粉室温振荡封闭1 h，与1∶200稀释后的一抗4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，然后与1∶5000稀释后的HRP标记的二抗室温孵育2 h，PBST洗膜3次，DAB显色检测目的蛋白.
1.2.7免疫荧光检测MCHR2蛋白在细胞中的定位细胞爬片48 h后用PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，500 mL/L兔血清封闭30 min，倾去兔血清，加入按1∶100稀释的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入按1∶200稀释的FITC标记的二抗，室温孵育2 h，PBS洗3次，500 mL/L甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照.
2结果
2.1人MCHR2全长cDNA的获取以人胎脑cDNA文库为模板，利用MCHR2特异性的引物进行PCR扩增，产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定. 所获PCR片段约为1023 bp，与预期的人MCHR2 cDNA全编码区的长度相符(图1).
1：DNA Marker(DL 2000)；2：MCHR2 PCR片段.
图1人MCHR2全长cDNA的PCR扩增（略）
2.2真核表达载体pcDNA3.1MCHR2的鉴定双酶切鉴定显示(图2)，重组质粒pcDNA3.1MCHR2经EcoR I和Xho I酶切后得到两条条带，一条约为1.0 kb大小的目的条带，一条为5.4 kb大小的空载体条带，而pcDNA3.1(+)空质粒只有一条5.4 kb的条带；PCR鉴定结果为(图3)，重组质粒pcDNA3.1/MCHR2经PCR扩增得到一清晰的1023 bp的目的条带，长度与MCHR2 cDNA长度相符，而pcDNA3.1(+)空质粒PCR结果无条带出现；以pcDNA3.1(+)质粒载体多克隆位点上的通用引物进行测序，证实pcDNA3.1/MCHR2重组质粒插入片段的序列与MCHR2的cDNA序列完全一致，表明人MCHR2的真核表达载体构建成功.
1：DNA Marker(DL 15 000)；2：pcDNA3.1(+)；3：pcDNA3.1MCHR2.
图2pcDNA3.1MCHR2重组质粒的双酶切鉴定（略）
1：DNA Marker(DL 2000)；2：pcDNA3.1(+)；3：pcDNA3.1MCHR2.
图3pcDNA3.1MCHR2重组质粒的PCR鉴定（略）
2.3细胞克隆中MCHR2 mRNA的表达细胞总RNA中MCHR2基因mRNA水平的RTPCR分析(图4)表明，稳定转染pcDNA3.1MCHR2的细胞(命名为HEK293MCHR2)所提RNA能扩增出代表MCHR2基因(1023 bp)及内参GAPDH基因(450 bp)的条带，而稳定转染pcDNA3.1(+)空质粒的细胞(命名为HEK293mock)所提RNA仅能扩增出代表内参GAPDH基因的450 bp的条带，说明MCHR2基因在稳定转染pcDNA3.1MCHR2的HEK293细胞中mRNA水平上得到了表达.
1：DNA marker(DL 2000)；2：HEK293mock；3：HEK293MCHR2.
图4稳定转染pcDNA3.1MCHR2细胞的RTPCR分析结果（略）
1：HEK293mock；2.：HEK293MCHR2.
图5稳定转染pcDNA3.1MCHR2细胞的的Western Blot分析结果（略）
图6稳定转染pcDNA3.1MCHR2细胞的免疫荧光检测（略）
3讨论
MCH是由下丘脑分泌的能够增强食欲的神经肽，在调节能量平衡和体质量方面起重要的作用［2-4］，并且参与了认知、记忆、焦虑和抑郁等情绪反应［5］，因而在肥胖症的发生发展中扮演着重要的角色. MCHR2则是近年来新发现的MCH的受体亚型［6-8］，与MCHR1有38％的氨基酸一致性，也属于G蛋白偶联受体家族，其生物学功能尚不清楚. 通过基因敲除技术研究MCHR1的功能［9-10］发现MCHR1敲除小鼠并不象MCH敲除小鼠［11］一样表现为进食减少进而体质量减轻，而是表现为进食增多，其体质量则由于活动增多和代谢增强而维持正常或略低于正常，这种差异的存在推测可能是MCH的另一个受体存在的缘故. 那么，MCHR2对进食行为以及体质量的调控作用是否起关键作用，它与肥胖发生发展的关系如何，它是否参与了认知、记忆、焦虑和抑郁等情绪反应的调控，诸如此类有关MCHR2基因的生理功能就成为人们日益关注的问题.
将基因克隆到真核表达载体中，转入到该基因的宿主细胞，从而观察宿主细胞的变化是研究基因功能的一种有效方法. 我们以人胎脑cDNA文库为模板通过PCR的方法获得了人MCHR2 cDNA编码区，并成功地将其插入pcDNA3.1(+)载体的CMV启动子下面，构建了MCHR2的真核表达载体. 经酶切和PCR鉴定后，用载体通用引物测序证明序列准确无误后，通过脂质体介导将pcDNA3.1MCHR2重组载体转染HEK293细胞，通过G418筛选建立了稳定转染细胞系，即HEK293MCHR2. 为鉴定该细胞系是否能正确表达目的蛋白，我们以空质粒转染细胞为对照，用RTPCR和Western Blot方法分别从转录水平和蛋白水平检测了MCHR2基因的表达，结果表明重组的人MCHR2基因在HEK293细胞中能被有效地转录和翻译. 但如果一个细胞群体仅有个别细胞表达目的蛋白，用上述2种方法都不得到理想的结果，而应用免疫荧光技术，理论上可以检测到单个细胞是否表达目的蛋白，并且通过观察细胞内荧光的分布可判断蛋白在细胞内的定位. 因此，我们又用免疫荧光检测了MCHR2的表达，结果显示稳定转染重组质粒的细胞均有MCHR2的阳性表达，且主要分布在细胞的胞质与胞膜上，与其跨膜受体的性质相吻合，进一步证实所获得的稳定转染细胞系能够有效准确地表达MCHR2蛋白，并且与抗体有良好的结合活性，可以用于后续生物学活性及信号转导通路的研究，并且为今后筛选有效的siRNA，从而利用RNAi技术构建mchr2基因敲除的动物模型提供了良好的细胞模型.
综上所述，我们运用基因工程方法成功构建了pcDNA3.1MCHR2真核表达载体，通过脂质体转染及G418筛选建立了稳定表达MCHR2基因的细胞系，为研究MCHR2基因的生物学功能奠定了基础，也为筛选和制备MCHR2的抑制剂创造了条件.
【
参考文献
】［1］ Harrold JA， Williams G， Wong S. Neuroendocrine targets for the treatment of obesity: Physiological roles and unrealized opportunities ［J］. Curr Med ChemCentral Nervous System Agents， 2003， 3(3): 141-155.
［2］ Qu D， Ludwig DS， Gammeltoft S， et al. A role for melaninconcentrating hormone in the central regulation of feeding behaviour ［J］. Nature， 1996， 380(6571): 243-247.
［3］ Elliott JC， Harrold JA， Brodin P， et al. Increases in melaninconcentrating hormone and MCH receptor levels in the hypothalamus of dietaryobese rats ［J］. Brain Res Mol Brain Res， 2004， 128(2): 150-159.
［4］ Ludwig DS， Tritos NA， Mastaitis JW， et al. Melaninconcentrating hormone overexpression in transgenic mice leads to obesity and insulin resistance ［J］. J Clin Invest， 2001， 107(3): 379-386.
［5］ Katsuura G， Inui A. MelaninConcentrating hormone as a metabolic and cognitive regulatory factor ［J］. Curr Med ChemCentral Nervous System Agents， 2003， 3(3): 217-227.
［6］ An S， Cutler G， Zhao JJ， et al. Identification and characterization of a melaninconcentrating hormone receptor ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98(13):7576-7581.
［7］ Hill J， Duckworth M， Murdock P， et al. Molecular cloning and functional characterization of MCh3， a novel human MCH receptor ［J］. J Biol Chem， 2001， 276(23):20125-20129.
［8］ Sailer AW， Sano H， Zeng Z， et al. Identification and characterization of a second melaninconcentrating hormone receptor， MCh3R ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98(13):7564-7569.
［9］ Marsh DJ， Weingarth DT， Novi DE， et al. Melaninconcentrating hormone 1 receptordeficient mice are lean， hyperactive， and hyperphagic and have altered metabolism ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99(5): 3240-3245.
［10］ Chen Y， Hu CK， Hsu CK， et al. Targeted disruption of the melaninconcentrating hormone receptor1 results in hyperphagia and resistance to dietinduced obesity ［J］. Endocrinology， 2002， 143(7): 2469-2477.
［11］ Shimada M， Tritos NA， Lowell BB， et al. Mice lacking melaninconcentrating hormone are hypophagic and lean ［J］. Nature， 1998， 396(6712): 670-674.