作者：黄学勇 段广才 范清堂 郗园林 黄志刚 宋春花
【关键词】 幽门螺杆菌；omp22
【Abstract】 AIM： To construct a prokaryotic high expression system which expresses fusion gene of outer membrane protein （omp22） gene and adhesion gene hpaA from Helicobacter pylori. METHODS： The omp22hpaA fusion gene with an adapter of 3 glycine residues was amplified by PCR， and cloned to the expression vector pMALc2X. The constructed recombinant plasmid was transformed in E.coli TB1 host bacterial strain and was induced by IPTG. The expression products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot. RESULTS： Sequencing results showed that the omp22hpaA fusion gene consisted of 1326 bp and encoded the polypeptides of 440 amino acids and that the sequence (GGTGGAGGC) encoding 3 glycine residues was inserted into omp22hpaA fusion gene as an adapter. The relative molecular weight of the expression product of omp22hpaA fusion gene was about 53 ku. The amount of the recombinant gene expression products accounted for 20% of the total proteins of the host bacteria. CONCLUSION： The omp22hpaA fusion gene has been cloned and a prokaryotic high expression system for omp22hpaA fusion gene been successfully constructed.
【Keywords】 Helicobacter pylori; omp22hpaA fusion gene; cloning; gene expression
【摘要】 目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp）的外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因的重组蛋白质候选菌株，为Hp疫苗研究提供依据. 方法：用PCR方法扩增出带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因omp22hpaA， 将其克隆到表达载体pMALc2X中转化大肠杆菌(E.coli TB1)，用IPTG诱导目的基因表达，SDSPAGE方法对表达产物进行分析，Western Blot鉴定其免疫原性. 结果：测序结果显示， omp22hpaA融合基因片段由1326 bp组成，为编码440个氨基酸残基的多肽，接头序列GGTGGAGGC已成功地插入omp22hpaA融合基因中；SDSPAGE结果显示表达产物相对分子质量约为53 ku，融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的20%. 结论：成功克隆并构建了omp22hpaA融合基因原核表达系统.
【关键词】 幽门螺杆菌；omp22hpaA融合基因；克隆；基因表达
0引言
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori， Hp)是人类最常见的致病菌. 目前采用联合应用抗生素通常能有效地清除感染的Hp，但存在患者耐受性差、费用高及药物副作用明显等缺点［1-2］，因此，接种疫苗是预防Hp感染、控制相关疾病最为有效的方法. 黏附素(hpaA)是Hp鞭毛鞘膜蛋白，序列高度保守，作为基因工程疫苗的保护性候选抗原已被证实［3-4］；Hp的外膜蛋白在人体保护性免疫反应中具有重要的作用，并为该菌的共有抗原成分，以其制备的抗原可使实验动物获得保护［5-6］. 我们通过引入柔性接头构建了omp22hpaA融合基因原核表达系统，为研究Hp基因工程组分疫苗和免疫检测试剂应用研究提供依据.
1材料和方法
1.1材料HpMELHP27株由本研究室分离保种;表达质粒pMALc2X和菌株E.coli TB1（New England Biolabs公司）；含有omp22基因克隆质粒pBSomp22和含有hpaA基因克隆质粒pBShpaA（本实验室构建）；Pyrobest DNA聚合酶，限制性内切酶BamHＩ和HindⅢ，T4 DNA连接酶（宝生物公司）；DNA纯化试剂盒（Vitagene公司）；Hp患者血清采集于郑州市某厂职工体检（商品化试剂盒检测阳性）.
1.2方法
1.2.1PCR扩增参考GenBank收录的Helicobacter pylori国际标准株J99和26695的基因序列，应用Primer 5.0设计Hp外膜蛋白omp22， 黏附素hpaA基因的PCR引物如下. P1： 5′cgggatccatgaagagatcttc3′； P2： 5′tttgcctccacccttcactaattt3′； P3： 5′aagggtggag gc aaagcaaataatc3′；P4：5′cgcaagcttttatcggtttct3′. 该组引物由赛百盛公司合成，P1和P2用于扩增上游的omp22基因，P3和P4用于扩增下游的hpaA基因，并在P1的5′端加BamHＩ酶切位点，在P4的5′端加HindⅢ酶切位点. 在omp22下游和hpaA上游有15个碱基重叠，其中接头为9个碱基（引物中下划线部分为接头），并去除omp22基因的终止密码子和hpaA基因的起始密码子，以利于这两个基因互为引物和模板扩增出插入柔韧接头编码序列的融合基因omp22hpaA. ①omp22的PCR扩增体系50 μL：其中10×buffer 5 μL， 4×dNTP 4 μL(各200 μmol/L)， pBSomp22质粒（模板） 2 μL，P1，P2引物各2 μL (0.25 μmol/L)， Pyrobest DNA聚合酶0.4 μL (1.25 Ｕ)，最后加MilliQ h3O至终体积. PCR扩增条件：95℃预变性5 min，然后按以下参数进行30个循环：94℃变性50 s，45℃退火45 s，72℃延伸50 s，最后一个循环72℃反应10 min. ②hpaA的PCR扩增：参照omp22扩增体系和条件. ③omp22hpaA融合基因PCR扩增体系50 μL：根据紫外分光光器定量，模板omp22 PCR产物和hpaA PCR产物分别为1.5， 2.0 μL. P1， P4引物各2 μL (0.25 μmol/L)，其它同omp22扩增体系. 扩增条件：95℃预变性5 min，然后按以下参数进行30个循环：94℃变性50 s，46℃退火50 s，72℃延伸90 s，最后一个循环72℃反应10 min. 取PCR产物3 μL，在含EB的10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，切下目的DNA片段，用Vitagene凝胶回收试剂盒回收，凝胶图像分析仪照相.
1.2.2omp22hpaA融合基因表达载体的构建将以琼脂糖凝胶中回收的omp22hpaA融合基因和空质粒pMALc2X分别用BamHＩ和HindⅢ双酶切，酶切体系为20 μL，其中10×K buffer 2 μL，PCR产物或空质粒pMALc2X 10 μL， BamHＩ和HindⅢ各1 μL，加MilliQ h3O至终体积. 37℃作用2.5 h. 酶切产物分别用Vitagene凝胶回收试剂盒回收，凝胶图像分析仪定量. omp22hpaA与pMALc2X以6∶1的浓度比例进行混合，T4 DNA酶16℃过夜连接. 取连接产物10 μL转化E.coli TB1感受态细胞，将转化菌均匀涂布于含Xgal和IPTG的LB氨苄青霉素固体培养基上，37℃培养12～16 ｈ. 挑选白色菌落，接种于5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃， 220 r/min培养过夜，碱裂解法提取质粒，进行单、双酶切和PCR扩增鉴定. 阳性重组质粒命名为pMALc2Xomp22hpaA.
1.2.3omp22hpaA融合基因序列测定鉴定后的阳性重组克隆质粒pMALc2Xomp22hpaA送上海生工生物工程技术服务有限公司，以P1，P4为引物进行核苷酸测序.
1.2.4目的基因的诱导表达将鉴定过的阳性克隆菌落接种到含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃， 200 r/min摇菌过夜. 取50 μL菌液加入到5 mL LB液体培养基中，37℃，240 r/min，摇菌2 h，加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG，诱导表达6 h.
1.2.5基因表达产物SDSPAGE分析取菌液样品1 mL，10 000 g离心3 min，弃上清，加入100 μL 1×SDSPAGE上样缓冲液，100℃水浴5 min， 10 000 g离心10 min，取上清加样. 用0.5 mg/L浓缩胶和1.2 mg/L分离胶电泳约2.5 h. 凝胶用考马斯亮蓝R250染色.
1.2.6表达产物的Western Blot分析SDSPAGE电泳后，凝胶和硝酸纤维素膜在转移缓冲液中浸泡15 min，于半干式电转印仪中20V转印40 min. 硝酸纤维素膜用蒸馏水洗3次，PBS洗1次，转入封闭液，封闭3 h，与Hp患者血清(1∶50)反应2 h，洗膜后与羊抗人血清(1∶2000)反应1 h，DAB显色，同时以健康人血清做对照.
2结果
2.1PCR扩增产物PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增产物长度分别为550，790 bp(图1)和1326 bp(图2).
1: DNA marker; 2，3: hpaA基因的扩增产物; 4，5: omp22基因的扩增产物.
图1Hp hpaA，omp22基因的PCR扩增产物（略）
2.2omp22hpaA融合基因表达质粒构建及鉴定将重组表达质粒分别用BamHＩ和HindⅢ单、双酶切以及重组表达质粒的PCR产物同时在10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳(图3)，均获得预期大小目的基因片段，表明表达质粒构建成功.
1: DNA marker; 2，3: omp22hpaA融合基因的扩增产物.
图2琼脂糖凝胶中回收到的omp22hpaA融合基因（略）
1: DNA marker; 2: pMALc2X质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切; 3:重组质粒(pMALc2Xomp22HpaA) HindⅢ单酶切; 4:重组质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切; 5:以重组质粒为模板的PCR扩增产物.
2.3omp22hpaA融合基因测序omp22hpaA融合基因中上游omp22和下游hpaA基因与以前所测核苷酸序列一致，而且3个甘氨酸残基的编码序列GGTGGAGGC作为柔韧性接头已成功插入omp22hpaA融合基因中，图4下划线部分为接头.
下划线部分为接头，接头上游是omp22基因，删除了终止密码子TAA，下游是hpaA基因，删除了起始密码子ATG.
图4融合基因部分测序结果（略）
2.4诱导表达产物的SDSPAGE结果将重组菌TB1(PMALc2Xomp22hpaA)和对照菌TB1(PMALc2X)以及TB1诱导后的粗提蛋白进行SDSPAGE电泳，重组菌体蛋白在约96 ku处出现一条特异蛋白带(图5)，经Gene Genius凝胶图像分析仪分析，融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的20%，该蛋白分子质量与预期融合表达蛋白分子质量一致. 初步证实所构建的重组表达质粒pMALc2Xomp22hpaA可以高效表达融合蛋白omp22HpaA.
1:低分子质量蛋白marker; 2:E.coli TB1诱导6 h; 3: TB1(pMALc2X)诱导6 h; 4，5:TB1(pMALc2Xomp22hpaA)诱导6 h.
图5TB1(pMALc2Xomp22hpaA)诱导表达产物的SDSPAGE分析（略）
2.5表达产物的Western Blot分析重组菌TB1(pMALc2XhpaA)表达产物与Hp患者血清进行Western Blot分析，在约96 ku处产生特异杂交带（图6），进一步证实获得了目的蛋白的表达.
1:TB1(pMALc2Xomp22hpaA)诱导后与健康人血清Western Blot反应; 2: TB1(pMALc2Xomp22hpaA)诱导后与Hp患者血清Western Blot反应.
图6romp22HpaA免疫原性的Western Blot分析（略）
3讨论
国内外大量的研究表明，基因工程疫苗是防治Hp感染的一种很有前途的手段［7］. 目前已经证实的Hp有效保护性抗原成分有HspA，UreB，VacA，CagA，NAP，Lpp20，omp11和过氧化氢酶等，然而大量的动物实验研究显示这些抗原单独使用时免疫保护效果并不十分理想，多种组分混合以及融合蛋白疫苗的研究已成为本领域的研究热点.黏附是Hp感染的先决条件，也是致病的关键，编码黏附素的hpaA基因为Hp所特有，且序列高度保守，编码蛋白产物HpaA的免疫原性已被动物实验证实，并证实了在机体抗Hp感染中sIgA是黏膜免疫反应中重要的保护性抗体，目前认为是仅次于UreB的疫苗候选抗原［8］. 外膜是革兰阴性细菌表面的一种连续性结构，有研究表明，革兰阴性细菌外膜中的一些蛋白成分具有良好的抗原活性，可诱导出很强的菌株特异性免疫反应，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素. Hp基因组中含有34个功能有待进一步研究的外膜蛋白(outer membrane protein， omp)基因，如Lpp20，omp25，omp26，omp27等具有良好的免疫活性［9-11］，提示外膜蛋白分子可以成为Hp疫苗研究良好的候选抗原.
我们选择Hp的omp22和hpaA基因，在omp22上游和hpaA下游加上合适的酶切位点，两基因中间通过柔韧接头连接，避免二者在折叠过程中空间结构的相互影响， 从而保留各自抗原性［12］. 通过PCR方法获得郑州分离Hp菌株MELHP27的omp22和hpaA基因， 二者再互为模板和引物扩增出omp22hpaA融合基因，成功插入表达载体pMALc2X，测序结果证实了柔韧性接头正确插入和整个融合基因阅读框正确. 通过IPTG诱导和SDSPAGE蛋白电泳，发现重组细菌在相对分子质量95 ku处出现一条特异带，正好是标签蛋白MBP相对分子质量(42.5 ku)与omp22的相对分子质量(24 ku)， HpaA的相对分子质量(29 ku)的总和，与预期融合蛋白相对分子质量相符，表明成功构建了omp22HpaA融合蛋白重组原核表达系统，为进一步omp22HpaA重组融合蛋白的抗原性和免疫保护性研究以及Hp基因工程疫苗和临床诊断试剂研制打下了基础.
参考文献
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